三种快速检测方法对结核性脑膜炎早期诊断的价值

封彬彬， 董 芸， 林美英， 周洪顺， 李 铭， 邱丽华

结核性脑膜炎（TBM）是由结核分枝杆菌引起最严重的肺外结核病，占所有肺外结核病的5%～10%，致残率、致死率高[1]，即使给予抗结核药物治疗，死亡率仍可高达10.0%～36.5%[2]。早期诊断灵敏度和特异度较高的实验室检测方法对TBM患者改善预后具有重要意义。结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）技术是基于抗原特异性细胞免疫应答反应检测技术，对诊断结核感染的灵敏度及特异度均很高。腺苷脱氨酶 （ADA）是嘌呤代谢中与机体细胞免疫活性有关的重要酶类，结核分枝杆菌感染后，可引发机体免疫功能紊乱，释放ADA，检测周期短、费用低。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（GeneXpert MTB/RIF）是可用于结核病诊断且为WHO认证的新方法[3]，GeneXpert MTB/RIF既可以对有无结核分枝杆菌进行检测，同时还可以对其有无利福平耐药基因突变进行判定，检测只需2 h。本文回顾性对原山东省胸科医院收治的105例脑膜炎患者的以上三种快速实验室检测结果进行研究，探究其在结核性脑膜炎早期诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 资料来源

选取2018年4月1日—2020年12月31日收治的确诊TBM组患者47例，其中仅脑脊液Xpert MTB/RIF检测阳性患者13例、仅脑脊液分枝杆菌培养阳性17例、两者均阳性17例；非TBM组患者58例，其中病毒性脑膜炎46例、化脓性脑膜炎8例、隐球菌脑膜炎3例、诺卡菌脑膜炎1例。对两组外周血T-SPOT.TB、脑脊液ADA、脑脊液Xpert MTB/RIF检测结果进行分析。

诊断标准[4]：有任何脑膜炎的症状或体征或脑影像学异常，且脑脊液结核分枝杆菌培养阳性经鉴定确定为结核分枝杆菌或脑脊液抗酸杆菌涂片阳性经鉴定确定为结核分枝杆菌或脑脊液结核分枝杆菌核酸扩增试验阳性。

排除标准：①脑脊液检查阴性；②影像学表现为颅内占位性病变、脑外伤等非感染性病变。

1.2 检测方法

1.2.1 T-SPOT.TB检测方法 收集患者静脉血4～6 mL，肝素/肝素钠抗凝，离心得到外周血单个核细胞（PBMC），洗涤后进行细胞计数。PBMC和结核特异抗原同时加入预包被抗体的反应孔中，37℃，5% CO2孵育过夜。效应T淋巴细胞释放细胞因子，与预包被的抗体结合。洗板，加入二抗，孵育1 h。洗板，加入底物显色液孵育7 min。蒸馏水终止反应。一个斑点代表一个效应T淋巴细胞。阳性结果参照标准：①阴性对照孔斑点数为0～5个，且抗原A或抗原B孔的斑点数-阴性对照孔斑点数≥6。②阴性对照孔斑点数为6～10个，且抗原A或抗原B孔的斑点数≥2×阴性对照孔斑点数。如果上述标准不符合且阳性对照孔正常时检测结果为“阴性”。

1.2.2 脑脊液ADA检测 取脑脊液标本1～2 mL， 以3 000～3 500 r/min的转速离心10～15 min，取上清液检测ADA。仪器采用西门子全自动分析仪ADVIA 2400，标本采用过氧化物酶法进行分析。脑脊液ADA的正常值为0～8 U/L。

1.2.3 Xpert MTB/RIF 取1.5～2 mL的脑脊液直接加入到Xpert试剂盒（美国赛沛公司）中，插入Xpert-MTB/RIF检测平台中。输入样本相关信息后，仪器自动过滤洗涤样本，超声溶菌释放DNA并与PCR反应试剂混合，半巢式实时扩增检测荧光信号，2 h后仪器自动给出检测结果。

1.2.4 定义 三种方法联合检测是三种检测方法中任意一种阳性则判断为阳性。

1.3 统计学处理

采用Excel 2016和SPSS 19.0软件对数据进行整理和统计学分析，使用Koimogorov-Smirnov test检验变量是否服从正态分布。正态分布的计量资料采用x±s表示。非正态分布的计量资料用中位数（四分位数）[median（P25，P75）]表示。两组数据符合正态分布的连续变量采用独立样本t检验。不符合正态分布的样本采用非参数秩和检验。计数资料的比较采用χ2检验，以受试者工作特征（ROC）曲线及曲线下面积（AUC）来分析不同试验方法的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TBM与非TBM患者基本资料比较

确诊为TBM患者47例，男24例，女23例，年龄17～74岁，平均（41.1±16.2）岁；非TBM患者58例，男34例，女24例，年龄15～81岁，平均（45.9±19.7）岁；两组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。TBM组脑脊液蛋白高于非TBM组，氯化物和糖低于非TBM组（P＜ 0.05）；脑脊液白细胞计数差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 TBM组与非TBM组脑脊液检查结果比较Table 1 Cerebrospinal fluid test results of tuberculous meningitis versus non-tuberculous meningitis

2.2 检测结果

外周血T-SPOT.TB、脑脊液ADA、脑脊液Xpert MTB/RIF检测及三种方法联合检测对结核性脑膜炎的阳性结果，在TBM组与非TBM组的差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 外周血T-SPOT.TB、脑脊液ADA、脑脊液Xpert MTB/RIF及联合检测对结核性脑膜炎的阳性结果Table 2 Positive rate of peripheral blood T-SPOT.TB, CSF-ADA, CSF Xpert MTB/RIF and combined tests in CSF in detecting tuberculous meningitis

外周血T-SPOT.TB的灵敏度、准确度分别为91.5%（43/47）、88.6%（93/105）高 于 脑 脊液ADA的21.3%（10/47）、61.9%（65/105）和脑脊液Xpert MTB/RIF的63.8%（30/47）、83.8%（88/105），灵敏度差异有统计学意义（χ2分别为47.108、10.363，P均＜0.05）。三种方法联合检测的灵敏度和准确度最高，分别为100%（47/47）和90.5%（95/105）。见表3。

表3 外周血T-SPOT.TB、脑脊液-ADA、脑脊液 Xpert MTB/RIF及联合检测结果Table 3 Performance of peripheral blood T-SPOT.TB, CSF-ADA, CSF Xpert MTB/RIF, and combined tests in diagnosis of tuberculous meningitis

2.3 三种检测结果ROC曲线分析

外周血T-SPOT.TB、脑脊液ADA和脑脊液Xpert MTB/RIF的ROC曲线的AUC分别是0.888、0.700和0.819。外周血T-SPOT.TB检测AUC值最高，为0.888（95%CI：0.819～0.958）。见图1。

3 讨论

TBM是中枢神经系统感染结核分枝杆菌后引起的非化脓性炎性疾病，常常导致神经损害或脑实质损害，易遗留严重的后遗症，甚至引起死 亡[5]。相关研究显示，TBM早期得到确诊的病死率不到10%，而晚期确诊的病死率可高达60%[6]。 因此及早诊断、有效治疗十分重要。脑脊液结核分枝杆菌培养阳性或抗酸染色阳性为诊断TBM的金标准，但脑脊液结核分枝杆菌的培养往往耗时较长（4～8周），阳性率仅在25%左右；抗酸染色其脑脊液检出率更低,脑脊液中MTB数量需超过1 000×103/L方能在镜下观察到[7]。对早期诊断TBM的价值极其有限。因此，寻找更好的早期诊断方法非常重要。

有研究表明，T-SOPT.TB检测在TBM的诊断中具有较高的特异度及灵敏度[8]，可作为早期辅助诊断的一项参考指标。T-SPOT.TB是一种酶联免疫斑点法，用于检测结核分枝杆菌特异性抗原EAST-6和CFP-10释放γ干扰素特异性T细胞数。单细胞水平的T-SPOT.TB检测能及时捕获细胞周围分泌的细胞因子，不受卡介苗接种和机体免疫状态的影响，其灵敏度和特异度均较高[9]。其他辅助诊断如结核菌素皮肤试验、结核抗体（TB-Ab）测定、结核特异性的核酸扩增检测等，常由于接种卡介苗引起假阳性、患者免疫功能低下导致实验假阴性，PCR方法技术要求高、无法区分死/活菌，且存在取样困难等问题限制了其在临床的应用[10]。中国近几年多项研究表明，外周血T-SPOT.TB诊断TBM的灵敏度为70%～91%，特异度为58%～87%[11-13]。本研究显示外周血T-SPOT.TB诊断TBM的灵敏度为91.5%，特异度为86.2%，准确度为88.6%，与上述报道基本一致。

脑脊液ADA是嘌呤核苷酸代谢的关键酶，参与机体T淋巴细胞增殖、分化过程，结核分枝杆菌感染会增加脑脊液ADA含量，通过测定ADA活性，有利于诊断TBM。Tuon等[14]通过对13宗研究分析发现，当脑脊液ADA正常值在1～4 U/L 时，其灵敏度＞93%，特异度＜80%，有助于排除TBM；＞8 U/L时，灵敏度＜59%，特异度＞96%，有助于TBM诊断。本研究显示脑脊液ADA的灵敏度为21.3%，特异度为94.8%，可见灵敏度明显降低，考虑可能原因：①白血病、AIDS等可导致机体免疫功能降低，进而影响脑脊液ADA检测结果，从而使ADA水平和阳性率减低[15]；②因大多数脑膜炎患者在就诊之前，曾进行过治疗，不排除使用抗结核药物及激素等，从而使体内激素水平发生变化，出现假阴性；③随着年龄的增大，ADA分泌也逐步下降[16]。

2010年GeneXpert MTB/RIF检测技术被WHO确认为用于诊断肺和肺外结核的方法[3]。荟萃分析表明，在确诊的TBM患者中脑脊液Xpert MTB/RIF检测有较高的准确率，灵敏度可达57%（38%～74%），特 异 度 为98%（89%～100%），在临床疑似患者中其检测的灵敏度仅有13%（6%～28%），特异度为98%（92%～100%）[17]。本研究显示Xpert MTB/RIF检测的灵敏度和特异度分别为63.8%和100%，灵敏度与以往研究相似。与传统培养法相比，Xpert MTB/RIF检测的灵敏度高，且在检测时间、自动化及耐药结果获取方面具有明显的优势[18]。

本研究中，采用ROC曲线及其AUC分析不同试验方法的诊断价值显示：外周血T-SPOT.TB、脑脊液ADA、脑脊液Xpert MTB/RIF检测的AUC值分别为0.888、0.700、0.819。外周血T-SPOT.TB的AUC值明显高于脑脊液ADA、脑脊液Xpert MTB/RIF检测。外周血T-SPOT.TB诊断TBM的灵敏度为91.5%，高于其他两种检测方法。由此可见，外周血T-SPOT.TB在早期TBM的诊断中价值较高。但是T-SPOT.TB检测不能有效区分活动性结核病或潜伏性结核感染，不能用于确诊或排除结核病，对于痰抗酸杆菌涂片及培养检查均阴性的结核病有辅助诊断价值。还需要结合临床症状、脑脊液常规、生化及其他早期诊断方法进一步明确诊断。本研究显示三种早期诊断方法联合的灵敏度为100%，准确度为90.5%，均高于三种单项检测方法，对TBM的诊断更有意义，值得临床 推广。

本研究的局限性：仅为一所医院数据，样本量少，仍需加大样本量及多中心研究进一步加以论证。总之，希望能发现更多新的标志物及新方法，为TBM的早期诊断提供更强有力的工具。