慢性刺激对糖尿病大鼠血清TNF-α和IL-18水平的影响①

孙艺萌，李子昂，王 娜，凌欣宇，王选杰，曲 鹏，杨利敏

(1.大连大学医学院，辽宁 大连 116622；2.河北医科大学，河北 石家庄 050017)

糖尿病(DM)尤其是2型糖尿病是目前最常见的慢性非传染病之一，发病率呈逐年递增的趋势，最值得关注的是DM 患者易并发心理疾病[1]。最新流行病学调查显示，DM患者并发抑郁症的发病率为28%，亚洲糖尿病合并抑郁症的发病率更高，为32%，约是正常人患抑郁症的3倍以上[2]。从临床数据来看，二者共病会使DM 患者出现长期焦虑、抑郁、更甚者会出现过激行为，导致患者死亡率增加[3]。研究发现，糖尿病与抑郁症在发病机理方面存在较强的相关性[4,5]，尤其是在炎症反应方面。近期研究发现糖尿病和抑郁症均伴随有炎性因子水平升高的现象，但炎性因子在糖尿病并发抑郁症中的作用尚不十分清楚。有研究发现，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素-18(IL-18)作为炎性反应中重要的炎性因子，广泛参与了糖尿病和抑郁症的发生发展过程[6, 7]，本研究通过观察慢性不可预知性刺激对糖尿病大鼠TNF-α和IL-18水平的影响，初步探讨炎症反应在糖尿病并发抑郁症病理机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级雄性SD大鼠30只，体质量250～300g，由大连医科大学实验动物中心提供。所有大鼠适应性喂养一周，自由饮水，昼夜节律正常，明暗周期为12h，环境温度25℃，湿度保持在55%左右。大鼠适应性喂养一周后开始制备动物模型。将30只大鼠随机分为3组，分别为正常组(Control组)10只，糖尿病模型组(DM组)10只，糖尿病合并抑郁症组(DM+UCMS组)10只。

1.2 动物模型的制备

DM大鼠模型的制备：在进行实验前，将大鼠预养一周，并给予UCMS组与DM+UCMS组大鼠高脂高糖饮食一周，在造模前24h之内对大鼠进行禁食不禁水处理，一次性尾静脉注射链脲佐菌素(2% STZ,溶于配制的0.1mol/L,pH=4.45 柠檬酸缓冲中35mg/kg)，其他组不做处理。造模72h后，对各组大鼠禁食12h，并空腹测量大鼠血糖，DM模型组对大鼠的要求为空腹血糖≥11.1mmol/L，高脂高糖饮食继续喂养(比例为面：糖：油：鸡蛋=1：0.4:0.3:0.2)，UCMS+DM组必须单笼喂养，DM组和正常组可处群居状态。DM+UCMS大鼠模型的制备：本实验采用高脂高糖饮食联合尾静脉注射 2% STZ、结合不可预知慢性刺激的方法建立糖尿病合并抑郁症动物模型，即 DM+UCMS 组大鼠模型，慢性不可预知性刺激包括8种：电击足底30min，禁食40h，禁水24h，4℃冰水游泳5min，45℃热刺激5min，黑白颠倒24h，无刺激24h，夹尾1min。每天随机给予大鼠以上8种刺激中的一种，慢性温和不可预知性刺激持续28d。

1.3 模型制备成功标准

DM模型制备成功标准为实验后大鼠空腹血糖≥11.1mmol/L[12]，进食减少且体重降低，饮水量及尿量明显增加，部分大鼠可能会出现易怒状态。

DM+UCMS模型制备成功标准为实验后大鼠游泳和挣扎时间明显缩短，漂浮时间明显增加，毛色暗沉，部分大鼠可能出现烂尾情况；大鼠空腹血糖≥11.1 mmol/L。

1.4 指标检测

1.4.1 强迫游泳实验(FST)

分别将对照组、DM组、DM+UCMS组大鼠进行强迫游泳，检测其行为学指标。根据文献描述[8]，在慢性刺激结束后对大鼠进行强迫游泳实验，该实验由两部分组成，强迫游泳24h前给予大鼠15min预游泳，使其适应游泳环境，24h后监测大鼠6min游泳行为，统计大鼠漂浮时间、游泳时间和挣扎时间。将大鼠放进水温为23～25℃，长348mm，宽348mm，高445mm的有机玻璃水箱中，使大鼠后肢不能靠玻璃水箱底部支撑身体。每一只大鼠都需更换干净清洁的水，防止粪便等物质干扰大鼠游泳行为。游泳结束后，擦干大鼠，放回笼内。本实验使用购于成都泰盟软件有限公司FST-100睡眠剥夺与强迫游泳实验系统。

1.4.2ELISA法检测血清TNF-α和IL-18水平

内眦静脉采血法采取DM组、DM+UCMS组、正常组大鼠空腹全血。10000rpm离心10min后取上清，分装保存于-20℃冰箱，避免反复冻融。应用ELISA法测定大鼠血清TNF-α和IL-18水平，全自动酶标仪检测样本OD值，计算浓度，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，ELISA试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，货号分别为EK0526和EK0393。

1.5 统计学方法

采用prism软件，多组间比较采用单因素方差分析、组间比较采用Tukey检验；行为学实验前后数据采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量的变化情况

随着各种刺激的不断进行，与对照组大鼠比较，实验组的大鼠体重都有显著的变化，其中DM+UCMS组大鼠的体重最低，其次是DM组大鼠，慢性刺激对大鼠的饮食、情绪、行为等方面产生了一定的影响，使DM组大鼠的病情加重，身体状态不断下降，体质量也持续降低。统计学差异显著(*P<0.05)，见图1。

图1 各组大鼠体质量变化

2.2 实验前后大鼠强迫游泳指标变化

于制备模型后第4周末对对照组、DM组、DM+UCMS组大鼠进行强迫游泳，观察并记录大鼠上窜时间和不动时间的变化。与实验前相比，DM组和DM+UCMS组大鼠的上窜时间普遍显著减少(P<0.001)，DM+UCMS组上窜时间减少更明显；DM组和DM+UCMS组实验后的不动时间明显延长(P<0.05和P<0.001)，其中DM+UCMS组不动时间延长更显著，而对照组实验前后强迫游泳数据并无明显改变，表明慢性刺激加重了DM大鼠的抑郁样表现，见图2。

图2 各组大鼠实验前后强迫游泳指标

2.3 各组大鼠空腹血糖水平

与对照组相比较，DM组和DM+UCMS组大鼠空腹血糖明显升高(P<0.001)，DM组与DM+UCMS组之间并无显著差异(P>0.05)；同样的结果也见于血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数，即DM组与DM+UCMS组大鼠血清胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均较对照组明显升高(P<0.001)，但DM组与DM+UCMS组之间并无显著性差异，见图3。

图3 各组大鼠血糖、血清胰岛素及胰岛素抵抗指数

2.4 各组大鼠血清中TNF-α和IL-18的水平

ELISA结果显示，DM和DM+UCMS组大鼠的血清TNF-α和IL-18水平明显高于对照组(P<0.001)；与DM组相比，DM+UCMS组大鼠血清TNF-α和IL-18水平升高更明显(P<0.05)，其中DM+UCMS组大鼠血清IL-18较DM组升高具有非常显著性意义(P<0.001)，由此可见，IL-18与慢性刺激诱发糖尿病大鼠抑郁行为之间具有密切的相关性，有可能成为评估糖尿病并发抑郁症的一个血清学指标，见图4。

图4 各组大鼠血清中TNF-α和IL-18的水平

3 讨论

据世界卫生组织统计的数据显示，预估糖尿病的患病人群在2025年将上升至3亿[1]。糖尿病常带来许多的社会问题及各种心理障碍，其中最常见的就是抑郁症。近年来，国内外已有多位学者对糖尿病患者的抑郁情况以及影响因素进行研究，研究人员发现[9]，糖尿病患者中约有30%患抑郁症，而正常人群中抑郁症患病率仅约3.8 %。此外，有研究者发现，糖尿病合并抑郁症的患者在临床中的发病率高，导致患者对自我管理的有效性降低，增加了并发症的发生概率，提高了患者的致残率、致死率[10]。

近年研究发现，抑郁症和糖尿病患者中炎性细胞因子(IL-18、TNF-α)均升高[6, 7]。本研究结果亦显示，DM大鼠血清TNF-α和IL-18均明显高于对照组，而且慢性不可预知性刺激虽然对DM大鼠血糖、血清胰岛素及胰岛素抵抗指数无影响，但却可导致DM大鼠血清TNF-α和IL-18水平进一步升高，同时亦可导致DM大鼠抑郁样行为加重。本研究数据显示，慢性刺激对IL-18水平的影响更显著，说明 IL-18很可能是慢性刺激诱发DM大鼠并发抑郁症的关键因素，血清IL-18水平很可能是一个可以用来预测DM并发抑郁症的生物标记物，但其病理生理机制尚有待于进一步的实验研究加以确定。