外源一氧化氮(NO)对干旱胁迫滇润楠幼苗生长及生理特性的影响

宁 朋，李 燕，张 敏，王 菲，黄晓霞

(西南林业大学 园林园艺学院，国家林业与草原局 西南风景园林工程技术研究中心，云南 昆明 650224)

近年来，全球气候变暖以及环境破坏的加剧，使得水资源匮乏问题日益严峻，导致中国全国范围内干旱危害和水分缺乏日益加重[1].尤其是伴着城市化的快速发展，全国城市绿地面积高速增加，城市园林绿地灌溉用水量逐年增加，在水资源可供给量与社会总需求量矛盾日益尖锐的背景下，水资源匮乏问题在城市绿地发展和建设过程中尤其严重[2-3].因此选择抗旱性较强的园林植物以及通过有效手段增强园林植物的抗旱能力，对于当前水资源匮乏背景下城市绿地的建设与发展具有重要意义.

一氧化氮(NO)是普遍分布在植物体内的内源物质，作为一种信号分子，通过影响植物基因的表达，在植物的生长、发育及抗逆性调节等一系列生理过程的调控[4-5]中发挥着重要作用.前人研究表明，干旱使植物光合色素含量减少，光合速率和营养物质积累受到抑制[6-7]，而外源NO 可以促进抗氧化基因的表达，提高抗氧化酶活性，缓解活性氧的积累，降低丙二醛(MDA)含量，维持膜的稳定性[8]，调节可溶性渗透调节物质含量以维持细胞正常吸水[9]，从而增强植物的抗旱能力，维持植物在干旱环境下生物量积累和正常生长[10].此外，外源NO 也被发现可以提高植物抵御盐胁迫[11]、重金属胁迫[12]和低温胁迫[13-14]的能力.在SNP 的施用方式上，前人研究大多数以叶面喷施的方式对植物进行处理[9,13,15]，以浇灌的方式处理的研究较少[16]，更少有报道对两种施用方式及不同浓度的作用效果进行过对比研究.滇润楠(Machilus yunnanensis)为樟科润楠属常绿乔木，在云南地区城市绿化中作为主要乡土树种被广泛种植，其在绿化中对改善人居环境、提升生活质量方面具有重要作用，被评为昆明市民最喜爱的10 种园林绿化树种之一[17].本研究以半年生滇润楠幼苗为材料，探讨不同浓度外源NO 及其施用方式对干旱胁迫下滇润楠的生长及生理特性的影响，旨在为当前水资源匮乏背景下如何通过有效手段提升城市绿化树种抗旱能力提供一定的理论依据，也可为进一步探究外源NO 提高植物的抗逆性机制提供科学基础.

1 实验材料与方法

1.1 试验地概况试验地设在西南林业大学园林园艺学院后山苗圃大棚内(24°23′～26°22′N，102°10′～103°40′E)，年均温14.9 ℃，属于低纬度高原山地季风气候，年降水量1 011.2 mm，年蒸发量1 838.3 mm，相对湿度74%，全年无霜期在240 d 以上，年日照数2 196.7 h，日照百分率56%，年均总辐射量5 430 MJ·m−2，其中雨季2 630 MJ·m−2，干季2 800 MJ·m−2，两季之间差异不大.

1.2 实验设计于2020 年7 月选取半年生滇润楠实生苗，以腐殖土与红土质量比按3∶2 的比例混合作为栽培基质，种植于容量为3 L 的聚乙烯塑料花盆中.于2020 年8 月选取生长健壮，无病虫害，大小相当的幼苗进行实验处理.从移栽到处理这段时间，所有幼苗均保持水分充足.本研究参考Rahimian 等[15]的方法，以硝普钠(SNP)为外源NO 供体.如表1 所示，共设置6 个处理组.水分处理以隔天浇水补充水分至实验设计中相应的田间持水量，SNP 处理待土壤干旱程度达到50%～55%田间持水量后进行，D+S1 组、D+S2 组每天喷施1次SNP 溶液，因幼苗植株体较小，每株喷施溶液量为5 mL 即喷施均匀.D+W1 组、D+W2 组每天使用5 mL SNP 溶液进行根际浇灌处理.为减少误差，除D+S1 和D+S2 外其余各组每日叶面喷施5 mL纯水，除D+W1 和D+W2 之外其余各组每日使用5 mL 纯水进行根际浇灌.实验处理共3 个月，于2020 年11 月进行生长及生理指标测量.

表1 实验设计Tab.1 Experimental design

1.3 测定项目与方法

1.3.1 生长指标测定 用卷尺测量株高、根长；叶片相对含水量(LWRC)采用饱和称重法测定.在2020 年11 月处理结束时收获所有植株，洗净，每处理选取5 棵植株，量取株高及根系长度，取其平均值，并将根、茎、叶分开，放入烘箱80 ℃烘至恒重，称量植株根、茎、叶生物量、总生物量及叶片相对含水量.

1.3.2 光合指标测定 光合参数采用Li-6400XT便携式光合仪(美国LI-COR Biosciences 公司)测定.选择晴朗的天气，测定时间为光合作用比较活跃的9:00—11:00(温度24 ℃)，每处理选取3 株无病虫害植株的成熟功能叶片进行光合参数的测定，每株测3 片叶子，每片叶子重复5 次，最后取其平均值.测定植株净光合速率(Pn，μmol·m−2·s−1)、气孔导度(Gs，μmol·mol−1)、胞间二氧化碳浓度(Ci，mmol·m−2·s−1)、蒸腾速率(Tr，mmol·m−2·s−1)，测定时使用二氧化碳(CO2)钢瓶，物质的量比设定为400 μmol·mol−1，空气流速为1 L·min−1，光强为1 200 μmol·m·−2·s−1，叶温25 ℃，相对湿度60%.

1.3.3 其他生理指标的测定 每处理组选取3 株植株，每个指标在每植株取叶片0.2 g 进行生理指标的测定.光合色素采用丙酮−乙醇(等体积比)混合液浸提法进行测定；丙二醛(MDA)含量釆用硫代巴比妥酸法测定；脯氨酸(PRO)质量比采用茚三酮比色法测定；可溶性蛋白(SP)质量比测定采用考马斯亮蓝(G-520)染色法；过氧化物酶(POD)活性釆用愈创木酚法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑法测定；过氧化氢酶(CAT)活性和抗坏血酸过氧化物酶(APⅩ)活性采用紫外吸收法测定[18]，可溶性糖(SS)采用GOD-POD 比色法测定.

1.4 数据处理分别采用Excel 和SPSS 19.0 软件对数据进行初步统计和单因素方差分析(one-way，ANOVA)，采用Duncan 法进行多重比较(α=0.05)，采用Origin 2017 软件作图；采用ggcorrplot 包的“cor”函数进行pearson 相关性分析并采用“ggcorrplot”函数绘制相关性热图.柱状图与表格中数据均为平均值±标准误.

2 结果与分析

2.1 外源NO 对干旱胁迫滇润楠幼苗叶片相对含水量的影响叶片相对含水量是反映植物叶片水分状况的重要指标，可直接反映干旱环境下植物体内水分的亏缺情况.由图1 可以看出，与CK 相比，滇润楠幼苗的LRWC 在D 处理组中显著(P<0.05)降低，在SNP 处理后升高，其中0.1 mmol·L−1的叶片喷施处理(D+S1)和0.2 mmol·L−1的根际浇灌处理(D+S2)显著(P<0.05)提高了滇润楠幼苗的LRWC.

图1 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗叶片相对含水量的影响Fig.1 Effect of exogenous NO on leaf relative water content of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.2 外源NO 对干旱胁迫滇润楠幼苗生长的影响由表2 可知，干旱胁迫抑制了滇润楠幼苗的生长.相比CK，D 组的叶、茎、根生物量与总生物量分别降低了36.00%、33.33%、5.26%和25.27%，根冠比(R/S)增加了39.47%.SNP 处理有效促进了干旱胁迫下滇润楠幼苗生长和营养物质积累，其中0.1 mmol·L−1叶片喷施处理(D+S1)的叶、根生物量和总生物量相比D 组显著(P<0.05)增加、R/S上升了17.11%，且均高于SNP 喷施浓度更高的D+S2 处理组和根际浇灌处理组(D+W1，D+W2).

表2 干旱胁迫下外源NO 对滇润楠幼苗生长的影响Tab.2 Effect of exogenous NO on the growth of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.3 外源NO 对干旱胁迫滇润楠幼苗光合色素含量的影响由表3 可知，干旱胁迫显著(P<0.05)降低了滇润楠幼苗的叶绿素a(Chla)、叶绿素b(Chlb)、叶绿素(Chl(a+b))质量比，却使类胡萝卜素(Car)质量比、类胡萝卜素/叶绿素比值w(Car)/w(Chl)显著(P<0.05)增加.干旱胁迫下，滇润楠幼苗的Chla、Chlb、Chl(a+b)质量比在施用SNP 后增加，其中以低浓度(0.1 mmol·L−1)叶面喷施处理(D+S1)和高浓度(0.2 mmol·L−1)的根际浇灌处理增加最为显著(P<0.05).而Car 质量比和w(Car)/w(Chl)比值则在施用SNP 后降低.这表明0.1 mmol·L−1的SNP叶面喷施处理可显著(P<0.05)提高滇润楠幼苗的Chl 质量比，作用效果随着SNP 浓度的增高减弱；而在根际浇灌处理中则可能需要较高浓度(0.2 mmol·L−1)的SNP 处理才能显著(P<0.05)提高滇润楠幼苗的Chl 质量比.

表3 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗光合色素质量比的影响Tab.3 Effects of exogenous NO on photosynthetic pigment conents of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.4 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗丙二醛(MDA)含量的影响MDA 含量可以衡量植物细胞膜脂过氧化程度，其含量越高，表明细胞膜脂过氧化程度越高，细胞膜受到的伤害越严重.由图2可知，干旱胁迫使滇润楠幼苗的MDA 含量显著(P<0.05)增加.D+S1、D+S2、D+W1 和D+W2 处理组的MDA 含量相比D 分别降低了29.12%、29.67%、30.56%和26.02%.这表明外源NO 可有效减轻干旱胁迫下滇润楠幼苗的膜脂过氧化程度.

图2 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗叶片丙二醛含量的影响Fig.2 Effects of exogenous NO on MDA content in leaves of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.5 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗光合特性的影响由图3 可知，滇润楠幼苗的最大净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)均在干旱胁迫下显著降低，在SNP 处理后升高，在D+S1 处理组中显著(P<0.05)高于D处理组，且高于D+S2 处理组；D+W1 和D+W2 处理组的Pn均显著(P<0.05)高于D 处理，但是低于D+S1 处理.说明SNP 处理可有效缓解干旱胁迫对滇润楠幼苗光合特性的影响；并且以低浓度(0.1 mmol·L−1)SNP 叶面喷施处理作用效果最佳.

图3 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗光合参数的影响Fig.3 Effect of exogenous NO on photosynthetic parameters of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.6 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗渗透调节物质含量的影响脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)是植物体内的主要渗透调节物质，在植物抵御逆境的过程中发挥着重要作用.由图4可知，滇润楠幼苗的Pro、SS 含量在干旱胁迫下显著(P<0.05)升高，并且在SNP 处理后进一步升高，SP 质量比也在SNP 处理后增加.3 种渗透调节物质含量均在低浓度(0.1 mmol·L−1)的叶面喷施处理(D+S1)中达到最大值，且显著(P<0.05)高于D处理组；在2 个叶面喷施处理组(D+S1、D+S2)中分别高于同等SNP 浓度的两个根际浇灌处理组(D+W1、D+W2).

图4 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗渗透调节物质含量的影响Fig.4 Effect of exogenous NO on osmotic adjustment substance contents of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.7 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗抗氧化酶活性的影响植物在干旱胁迫下，活性氧含量增加，植物通过增强抗氧化酶活性以清除过量活性氧[15].由图5 可知，滇润楠幼苗的抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性在干旱胁迫下显著(P<0.05)增强；其中APX、POD 和CAT 活性在D+S1 处理组中显著(P<0.05)高于D 处理组，并高于D+S2 处理组.APX、POD 活性在D+S1处理组中显著(P<0.05)高于D+W1 处理组；而在D+S2 和D+W2两个处理组之间无显著差异.这表明较低浓度(0.1 mmol·L−1)的SNP 叶面喷施处理可有效提高滇润楠幼苗的抗氧化酶活性，在根际浇灌处理和高浓度(0.2 mmol·L−1)的叶面喷施处理时作用效果减弱.

图5 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗抗氧化酶活性的影响Fig.5 Effect of exogenous NO on antioxidant enzyme activities of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.8 施用SNP 后干旱胁迫下滇润楠幼苗生长及生理指标相关性分析由图6 可知，相关性分析显示，MDA 含量与SS 含量、Car 质量比、w(Car)/w(Chl)比值呈显著正相关关系，与Chl 质量比、Pn、Tr、Ci、Gs呈显著负相关关系.抗氧化酶(APX、CAT、POD、SOD)活性与Pro、SP、SS 含量呈显著正相关关系.(Chl)、R/S均与LRWC、总生物量呈显著正相关关系.

图6 滇润楠幼苗生长及生理指标相关性分析Fig.6 Correlation analysis of growth and physiological indexs of Machilus yunnanensis seedlings

3 讨论

3.1 干旱胁迫对滇润楠幼苗生长及生理特性的影响本研究中，滇润楠的生长及生理特性均受到干旱胁迫影响显著.干旱胁迫使滇润楠幼苗叶片含水量显著下降，并抑制了滇润楠幼苗的营养物质积累和正常生长，导致茎、叶生物量显著下降，而根生物量下降趋势并不显著，根冠比增加，这可能是由于植物可以通过提高对地下部分投资的比例、提高根冠比以增强对逆境的耐受能力[19].本研究中滇润楠幼苗的叶绿素质量比在干旱环境下显著下降，且相关性分析显示叶绿素质量比与丙二醛含量呈显著负相关，这可能是由于干旱环境中活性氧增加导致叶绿素降解、叶绿素合成酶活性受到抑制[20-21]；而滇润楠幼苗的类胡萝卜素质量比与w(类胡萝卜素)/w(叶绿素)比值均在干旱环境下显著增加，相关性分析显示类胡萝卜素质量比与丙二醛含量显著正相关.类胡萝卜素是一种抗氧化剂，可以清除光呼吸产生的H2O2、淬灭活性氧[22]，因此滇润楠幼苗类胡萝卜素质量比的升高可能是植物对干旱环境的一种适应机制[23-24].干旱胁迫导致滇润楠幼苗的净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳浓度均显著降低，表明此时气孔限制是滇润楠幼苗净光合速率降低的主要因素，可能是因为滇润楠幼苗在水分亏缺环境中关闭气孔以减少蒸腾失水，从而使净光合速率降低[25-26].脯氨酸、可溶性糖含量在干旱胁迫下均显著上升，表明滇润楠幼苗通过调节其渗透调节物质含量以应对水分亏缺环境，这是植物对干旱胁迫做出的积极响应[21].丙二醛含量在干旱胁迫下增加，表明滇润楠幼苗细胞膜的结构和功能受到破坏，这可能是由于干旱使植物体内活性氧和自由基大量产生，导致活性氧代谢平衡被打破，引发膜脂过氧化[8]，而超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶酶活性升高是植物应对不利环境下氧化胁迫的方式[15]，表明滇润楠幼苗通过调节其抗氧化酶活性以抵御干旱环境造成氧化胁迫.

3.2 外源NO 对干旱胁迫下滇润楠幼苗生长及生理特性的影响外源NO 显著缓解了干旱胁迫对滇润楠幼苗生长及生理特性的影响.无论是叶面喷施还是根际浇灌SNP，均有利于干旱下植株的生长.滇润楠幼苗的叶片含水量在SNP 处理后显著上升.有研究表明，NO 作为植物感知干旱胁迫的信号分子，可以促进ABA 的合成[27]，从而提高滇润楠植株的水分利用效率，维持植株细胞原生质体水分平衡，增强细胞稳定性，提高了叶片的保水能力[17].外源NO 可有效提高滇润楠幼苗的根冠比和生物量，相关性分析亦表明根冠比与生物量呈显著正相关关系，这可能是由于NO 作为生长素信号转导通路中的下游信号分子参与了植物不定根的发育，从而促进了植物根系生长[6]，进而使滇润楠幼苗的根冠比升高，抗旱能力增强.外源NO 提高了干旱胁迫下滇润楠幼苗叶绿素的含量，缓解了干旱胁迫对滇润楠幼苗光合特性的影响.有研究表明外源NO 减少了植物在干旱胁迫下活性氧的积累，保护了叶绿体膜的完整性，缓解了活性氧对叶绿素的破坏作用[8].滇润楠幼苗的净光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳浓度在施用外源NO 后得到提高，可能是由于外源NO 促进了硫化氢信号的生成[14]，硫化氢可以通过增加气孔开度和密度从而促进净光合速率升高[28]；另一方面，外源NO 也可以通过提高光合色素含量，增加PSⅡ反应中心的开放比例而提高植物的净光合速率[29].外源NO 能有效提高植物可溶性渗透调节物质含量，维持细胞渗透势，提高叶片细胞的保水能力[9].本研究亦表明外源NO 使干旱胁迫下滇润楠幼苗脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖的含量增加，提高了滇润楠幼苗的渗透调节能力.此外，脯氨酸不仅是一种重要的渗透调节物质，还参与了活性氧的清除，具有稳定生物大分子的结构的作用.可溶性糖是合成有机物质的碳架和能量来源，对细胞膜和原生质胶体具有重要的稳定作用，两者均对蛋白质有一定的保护作用，可防止酶脱水，兼做酶的保护剂[30].相关性分析显示，脯氨酸、可溶性糖含量与抗氧化酶活性呈显著正相关关系.据此推测，滇润楠幼苗脯氨酸和可溶性糖含量的升高可能对抗氧化酶起到了一定的保护作用，在一定程度上缓解了滇润楠幼苗的氧化胁迫.外源NO 增强了干旱下滇润楠幼苗抗氧化酶活性，降低了其丙二醛含量，缓解了滇润楠幼苗在干旱环境下受到的氧化胁迫，减轻了膜脂过氧化程度，维持了滇润楠幼苗细胞膜结构的完整性.可能是由于NO 作为一种信号分子，诱导了植物抗氧化基因表达，增强了抗氧化酶活性[31]，并且NO 还可以诱导AOX1a基因的表达，促使丙酮酸含量增加，从而增强抗氰替代途径以减少活性氧的产生[8].

高浓度的NO 与超氧阴离子相互作用生成过氧亚硝酸根阴离子[32].过氧亚硝酸根阴离子具有强氧化性，能破坏DNA 结构，氧化叶绿体蛋白质，并且引起不饱和脂肪酸氧化，使膜脂受到过氧化伤害[33].因此，许多研究均发现外源NO 的作用具有双重性，即低浓度的外源NO 处理可以有效增强植物的抗逆性，促进逆境下植物的生长，而高浓度NO 的作用效果则会减弱，甚至对植物产生毒害作用[6,15].本研究结果亦表明较高浓度的外源NO 喷施处理对滇润楠幼苗抗旱能力的提升效果减弱.再次证明了外源NO 的作用具有双重性.

本研究结果表明SNP 叶面喷施处理对滇润楠幼苗抗旱能力的提升作用效果好于根际浇灌处理.前人对叶面施肥的研究认为，与土壤施肥相比，叶面施肥的方式得益于叶片气孔和角质层孔隙的渗透性，使营养元素可以更快地进入叶肉细胞，利用效率更高[34]，尤其是在补充一些金属元素和微量元素时，叶面施肥的方式可以避免营养元素与土壤中其他元素的拮抗作用而提高吸收效率[35-36].据此推测，NO 作为一种气体信号分子，在叶面喷施的处理组中可能通过气孔而更快地进入叶肉细胞，相比于根际浇灌处理组更容易被滇润楠幼苗吸收，对滇润楠幼苗抗旱能力的提升效果更好.

4 结论

干旱胁迫显著抑制了滇润楠幼苗的生长，使其LRWC、生物量和净光合速率显著降低，MDA含量显著增加.同时干旱胁迫提高了滇润楠幼苗的类胡萝卜素质量比、渗透调节物质含量、根冠比和抗氧化酶活性.SNP 处理后，滇润楠幼苗的叶片相对含水量、叶绿素质量比、净光合速率、生物量、根冠比、渗透调节物质含量和抗氧化酶活性显著升高，MDA 含量显著降低.这表明外源NO 可以通过提高滇润楠幼苗的根冠比和渗透调节物质的含量，以增强其抗旱能力；增强了滇润楠抗氧化酶活性，减轻其膜脂过氧化程度；提高了叶绿素质量比，促进气孔开放，从而提高了滇润楠幼苗的净光合速率，维持其在干旱胁迫下的生物量积累和正常生长.在所有的SNP 处理组中，叶面喷施处理的作用效果要好于根际浇灌处理，并且外源NO 的作用具有双重性，较低浓度(0.1 mmol·L−1)SNP 可有效提高滇润楠幼苗的抗旱性，而在较高浓度(0.2 mmol·L−1SNP)下，作用效果则会减弱.