双孢线虫草真菌群落结构及多样性分析

汤德相，王笑研，王元兵，孙 涛，胡卫红，虞 泓**

(1.云南大学 生态学与环境学院 云南云百草实验室，云南 昆明 650091；2.云南大学 中国（云南）−东南亚虫草生物资源可持续利用国际联合研究中心，云南 昆明 650091；3.云南大学 生命科学学院，云南 昆明 650091)

双孢线虫草（Ophiocordyceps bispora）为线虫草属（Ophiocordyceps）古老的物种，是亚洲新纪录种[1].Stifler[2]首次在非洲坦桑尼亚发现双孢线虫草，寄主为纳塔尔大白蚁（Macrotermes natalensis）.Sung 等[3]用多基因片段对双孢线虫草进行分子系统发育分析，确定双孢线虫草隶属于线虫草科（Ophiocordycipitaceae），线虫草属.目前，双孢线虫草的研究主要见于生物防治、活性成分以及微生物多样性等方面.双孢线虫草活性成分研究表明其含有丰富的核苷类、多糖及甘露醇等活性成分，双孢线虫草的菌丝体对果蝇具有延缓衰老的特性[1].

野外调查双孢线虫草发现该物种可以侵染白蚁（Macrotermessp.），致使巢穴中群居的白蚁大量死亡；在实验室内对双孢线虫草无性型研究也发现，让白蚁自由爬行在接有双孢线虫草分生孢子的无菌土壤上，可使白蚁感染；本课题组在野外调查也发现同样现象[1,4-6].通过高通量测序发现双孢线虫草具有丰富的真菌资源，不同生境下双孢线虫草的真菌多样性和群落结构具有差异[4]，该现象在其他虫草中也有报道，如冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）、新古尼异虫草（Metacordyceps neogunnii）和蝉花虫草（Isaria cicadae）等[7-9].本课题组野外调查发现，双孢线虫草分布在针阔混交林下，沿海拔梯度呈现不同密集程度的聚集死亡.研究报道山地生态系统海拔梯度差异较大，在较短的地理距离内可出现气候和生物特征的显著变化，环境梯度变化会影响微生物的群落结构、组成以及多样性[10].不同的光照强度（如背阴面和向阳面）会导致环境温度具有差异，从而影响微生物的分布格局[11].研究已证明海拔梯度和光照强度是影响微生物群落的关键因子[12].因此，海拔梯度可能是影响双孢线虫草微生物群落结构组成和多样性的重要因素.前人只对不同生境双孢线虫草微生物多样性进行了比较[4]，但对不同的海拔梯度以及其他环境因子，如光照强度对双孢线虫草真菌群落结构及多样性的影响没有进行深入研究.本研究初步探讨海拔梯度和光照强度对双孢线虫草真菌群落结构和多样性分布格局的影响，该研究可为双孢线虫草微生物群落中真菌资源挖掘与利用提供参考，同时为虫草真菌群落与环境相互作用提供研究思路.

1 材料和方法

1.1 样品采集双孢线虫草样本于2018 年7 月采自云南省玉溪市新平县新化乡（北纬24.12°，东经101.85°）.虫草样本处于成熟阶段，根据海拔梯度以及虫草分布特点，山的背阴面设置OFA，OFB 和OFC 样点，光秃的山顶设置OFD 样点，山的向阳面设置OFE 样点.固定样方10 m×10 m 内随机采集样本，每个样点采集5 份重复样（图1 和表1）.样本用75%酒精进行表面消毒2～3 min，30% 过氧化氢溶液浸泡3～5 min，再用无菌水冲洗3 次[13].将处理后的所有样本装入无菌离心管并放入液氮运回，保存于−80 ℃备用.

图1 双孢线虫草Fig.1 Ophiocordyceps bispora

表1 样本采集具体信息Tab.1 Sepecific information of sampls collected

1.2 DNA 提取、扩增及测序试剂盒 Micro Elute Genomic DNA Kit D3096 提取双孢线虫草总DNA，其操作步骤按照试剂盒说明书进行.琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度.用 ITS2 引物ITS4-2409R（5 ′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ′ ）和ITS3-2024F（5 ′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′）对目标区域进行扩增，反应过程如下：95℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30 个循环；最后72 ℃延长5 min.反应产物于Illumina MiSeq 进行上机测序.

1.3 数据处理与统计分析

1.3.1 序列优化 经Illumina MiSeq 高通量测序得到的序列根据Barcode 和PCR 扩增引物拆分出各样本数据，截去Barcode 和PCR 扩增引物得到reads，根据前端和后端序列之间的重叠关系，将成对的 reads 拼接成原始数据（Raw Tags），对原始数据进行截取、过滤和去除嵌合体序列后得到有效序列.

1.3.2 OTU 聚类及注释 用 Uparse 软件（v 7.0.1001，http://drive5.com/uparse/）按相似度≥ 97% 将有效序列聚类为 OTU（operational taxonomicunit），选取出现频数最高的序列作为OTU 代表序列，用Qiime 软件（Version 1.9.1）中blast（http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html）与Unit（https://unite.ut.ee/）数据库进行物种分类注释.已得到的序列数按54 780 bp 进行均一化处理，真菌群落结构和多样性分析基于每组样本数的平均值.Uparse 软件（v 7.0.1001）计算 Chao1、Ace、香农−威纳指数和辛普森指数.Excel 分析门、属和种水平上的真菌群落结构.Pearson 软件(v 3.7)分析真菌群落结构与海拔梯度之间的相关性，在线网络平台MetaCoMET（http://probes.pw.usda.gov/MetaCoMET）分析组间共有的核心 OTU.Anosim 分析真菌群落组内和组间的差异.

2 结果与分析

2.1 样本序列信息本研究采集的25 份样本，因3 份（OFA5、OFB3 和 OFC2）达不到建库要求被剔除，文中只对 22 份样本进行结果分析.22 份样本共获得有效序列为1 230 692 条，各样本有效序46 448～65 759 条，基于OTU Number 水平绘制稀释曲线，各样本OTU 为13～76 个，随着样本序列数的增加，可检测到的OTU 趋近于平缓状态，说明数据合理（图2）.22 份样本共得到445 个真菌OTUs，隶属于3 门、13 纲、41 目、69 科、66 属和257 种真菌物种.

图2 稀释曲线Fig.2 Rarefaction curve

2.2 双孢线虫草真菌多样性及群落结构分析

2.2.1 双孢线虫草真菌多样性分析 双孢线虫草各样点α多样性见图3.结果表明，OFC 样点多样性最高，OFB 样点次之，OFE 样点多样性最低.背阴面的样点随着海拔的升高，双孢线虫草真菌多样性也呈现逐渐升高的趋势.真菌多样性与海拔梯度相关性分析表明，真菌多样性与海拔高度不存在显著相关性（p>0.05，表2），OFD 比OFC 和OFB样点真菌多样性较低.出现这种结果可能是OFD、OFC 和OFB 样点的植被类型不同，OFC 和OFB 样点有茂密的草丛和树林遮挡，可以有效减少光的直接照射，光秃的山顶OFD 样点，其光照强度比向阳面OFE 样点更强.然而，OFD 样点的真菌多样性比OFE 样点高，OFE 样点人类活动比较频繁，且具有树林遮挡.因此，双孢线虫草真菌群落多样性可能受植被类型以及人为活动的影响.

图3 各样本α 多样性指数Fig.3 Alpha diversity index of each sample

双孢线虫草真菌丰富度最高为OFE 样点，OFA、OFB、OFC 和OFD 样点丰富度差异较小.随着海拔梯度的升高双孢线虫草真菌丰富度呈现上升−下降−上升的趋势.由表2 可见，真菌丰富度与海拔梯度不存在显著相关性（p>0.05）.OFB 样点的丰富度比OFC 样点高，出现这种现象可能OFB 样点的植被与OFC 样点不同.OFE 样点为山的向阳面，其光照强度和海拔梯度比OFD 样点弱，但OFE 样点的丰富度却比山顶OFD 样点高，OFE 样点是人类活动比较频繁的样点，并且有针阔混交林遮挡光照.双孢线虫草真菌群落丰富度可能不受光照强度的影响，人类活动和植被类型可能是影响双孢线虫草真菌多样性的因素.

表2 α 多样性指数与海拔梯度相关性分析Tab.2 Correlation analysis between alpha diversity index and elevation gradients

2.2.2 双孢线虫草真菌群落结构分析 双孢线虫草不同样点共得到445 个真菌OTUs，隶属于3 门、66 属 和257 个真菌物种.分别为子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota 和接合菌门Zygomycota（图4），其中子囊菌门为优势门，相对丰度为98.84%～99.95%.担子菌门和接合菌门相对丰度较低0.01%～1.1%.

图4 门水平上的真菌群落组成Fig.4 Fungal community composition at phylum level

双孢线虫草属水平分析结果显示（图5，6），线虫草属Ophiocordyceps为各样点优势属 84.85%～97.64%，图6 将线虫草属移除后对相对丰度>0.01%的属进行分析，结果显示，优势属枝穗霉属Clonostachys相对丰度为0.62%～14.61 %，多头霉属Polycephalomyces相对丰度为0.14%～8.48%，木霉 属Trichoderma0.03%～0.22%，Purpureocillium0.01%～0.16%，镰刀菌属Fusarium0.01%～0.04%和被孢霉属Mortierella0.01%～0.27%.随着海拔梯度及光照强度的变化，枝穗霉属和多头霉属相对丰度呈现先上升后下降的趋势，多头霉属相对丰度在OFB 样点达到最大值，枝穗霉属相对丰度在OFC 样点达到最大值，OFB 和OFC 样点植被与其他样点不同，两个优势属分别在OFB 和OFC 样点相对丰度达到最大值可能与植被类型有着密切的关系.

图5 属水平上的真菌群落组成Fig.5 Fungal community composition at genus level

图6 移除线虫草属后不同样点的真菌群落组成Fig.6 Fungal community composition of different samples after removed Ophiocordyceps

2.2.3 双孢线虫草核心OTU 分析 双孢线虫草组间的核心OTU 通过MetaCoMET 网络在线平台分析，结果显示，5 组样本得到445 个OTUs，OFA样点73 个，OFB 样点79 个，OFC 样点71 个，OFD样点92 个，OFE 样点130 个，5 个采样点共有41个核心OTUs（图7）.随着海拔梯度升高，背阴面的3 个样点OTUs 差异较小，OFD 样点的核心OTU比背阴面OFA、OFB 和OFC 样点多，OFD 的样本采自山顶，其光照强度、海拔梯度和植被类型与背阴面样点均不同，可能各样点核心OTU 受这3 种因素的影响.OFE 样点的核心OTU 最多，该样点为山的向阳面，海拔梯度比OFD 样点低，光照强度比OFD 样点弱，同时，OFE 样点具有稀疏的植被遮挡和人类频繁的活动.因此，各样点核心OTUs 可能不仅受光照强度的影响，植被类型和人类活动也是重要因素，这也与上文丰富度分析结果一致.

图7 不同样点的核心OTUsFig.7 Core OTUs of different sample

2.3 双孢线虫草真菌群落差异分析运用Anosim分析双孢线虫草的真菌群落在组间的差异是否显著大于组内差异，从而判断分组是否合理（图8）.结果显示，R=0.093，R>0 则说明各组间真菌群落具有显著差异.通过T-test 检验，OFE 和OFB 样点、OFE和OFC 样点、OFE 和OFD 样点两两比较发现，Mortierella在组间具有显著差异P<0.05（图9（a）～（c））.真菌群落和海拔梯度的相关性分析表明，其中14 个属与海拔梯度呈现正相关（图10）.

图8 不同样点Anosim 分析Fig.8 Anosim analysised in different of samples

图9 双孢线虫草真菌群落组间 T-test 检验Fig.9 Between groups of Ophiocordyceps bispora fungal community be T-tested

图10 真菌群落和海拔梯度相关性分析Fig.10 The correlation analysised of fungal community and elevation gradients

3 讨论

本文基于 Illumina MiSeq 高通量测序技术对 5组双孢线虫草样本进行 ITS2（internal transcribed spacer2）区域测序，以比较不同海拔梯度和光照强度下真菌多样性、丰富度和群落结构.测序结果表明，从22 份样本中共得到445 个真菌OTUs，隶属于3 门、13 纲、41 目、69 科、66 属和257 个真菌物种，显示出丰富的真菌资源.子囊菌门是广泛存在于虫草中的优势门，与冬虫夏草、蝉花虫草以及新古尼异虫草研究结果一致[7-9].除线虫草属为优势属外，还存在一些其他优势属，表明双孢线虫草也存在定植现象，这与蝉花虫草和新古尼异虫草研究结果相似[7-8].各样点其他优势属分别为枝穗霉属、多头霉属、木霉属、镰刀菌属、被孢属和Purpureocillium，随着海拔梯度及光照强度的变化，在各个样点真菌优势属相对丰度变化较小，但枝穗霉属和多头霉属相对丰度呈现先上升后下降的趋势，OFB 和OFC 样点的植被类型不同可能是影响枝穗霉属和多头霉属相对丰度变化的因素.值得关注的是，本文中真菌优势属与前人研究冬虫夏草优势属类群有所不同[9,13]，已有研究结果显示，枝穗霉属、木霉属、镰刀菌属在农作物病虫害防治和改善土壤环境方面具有重要作用[14-15]，并且还是土壤质量重要的检测指标，本文研究结果也侧面表明该地区受重金属污染较小，土壤环境质量较好[16].

随着海拔梯度的升高，双孢线虫草真菌多样性和丰富度呈现逐渐递增的趋势.双孢线虫草真菌多样性和丰富度与海拔梯度相关性分析结果表明，真菌多样性和丰富度与海拔梯度没有显著相关性（P>0.05），然而真菌群落和海拔梯度相关性分析结果显示，其中14 个属与海拔梯度呈正相关.这与暴家兵等[17]研究海拔梯度对细菌群落结构具有显著差异不一致.可能本文中各样点设置的海拔梯度距离较小，以及本文研究对象是真菌群落导致.双孢线虫草真菌群落多样性和丰富度除了受光照强度的影响外，可能还受植被类型以及人为活动的影响，适当的人为干扰是促成真菌群落多样性和丰富度较高的一个重要因素，与前人研究双孢线虫草微生物群落结构受生境影响的结果相似[4].

双孢线虫草核心 OTU 结果显示，随着海拔梯度升高，OFA、OFB、OFC 和OFD 样点OTUs 差异较小，向阳面OFE 样点的OTUs 明显多于其他4个样点，该样点的微生境（海拔梯度、光照强度、植被类型和人为活动）与其他样点不同，可能各样点核心OTUs 同时受海拔梯度、光照强度、植被类型和人为活动的影响.通过T-test 检验发现Mortierella属在OFB、OFC、OFD 和OFE 样点均具有显著差异（P<0.05）.研究报道，Mortierella对重金属污染较为敏感[16]，本文研究结果说明OFB、OFC、OFD和OFE 样点的重金属污染程度可能不同，导致差异形成的原因还有待进一步研究.