应用古DNA技术探究发酵微生物的适应、演化和驯化历史

郑泽权，付巧妹，刘逸宸

综 述

应用古DNA技术探究发酵微生物的适应、演化和驯化历史

郑泽权1,2,3，付巧妹1,2,3，刘逸宸1

1. 中国科学院古脊椎动物与古人类研究所，中国科学院脊椎动物演化与人类起源重点实验室，北京 100044 2. 中国科学院大学，北京 100049 3. 中国科学院生物演化与环境卓越创新中心，北京 100044

发酵生产是人类最原始的对微生物的应用和实践，在人类历史上具有重要意义。然而，由于分子证据的匮乏，人类发酵生产的演变历程及相关发酵微生物的演化和驯化历史尚不清楚。本文以目前最常见的两类发酵食品——酒及发酵乳品为例介绍了发酵食品考古和相关发酵微生物的演化和驯化研究，以及古微生物学和发酵古微生物的研究现状，并讨论了将微生物古DNA技术应用于古代发酵微生物研究的可行性和难点，展示了古DNA捕获技术在本领域的应用潜力，为发酵微生物演化研究提供了新的思路和方法。

发酵；微生物；古DNA；演化

利用微生物在食品原料上的发酵活动，水果、谷物和动物乳汁等原材料可以转化为酒和乳酪等发酵食品。这一过程不但丰富了食品的风味，更重要的是，提高了食品的保存时间和营养价值[1]。作为一种有益的食品生产和保存方法，发酵具有悠久的历史(表1)。早在公元前7000年，中国就有了酒的生产[2]。公元前6000年，西亚地区就开始发酵和制作乳酪[3]。现今，全球已有约六大类超过5000种发酵食品[4]，发酵食物和饮料已成为人类饮食中必不可少的重要组成部分。

迄今为止，人们对古人如何驯化微生物以进行发酵生产的历史仍知之甚少。驯化过程会在生物的基因组中留下典型的迹象，一个关键标志是生产环境对相关适应性基因的选择(选择过程中有利于适应的基因序列变异或拷贝数变异被保留下来)[8,9]。通过这些驯化痕迹，研究者能了解古人驯化发酵微生物并进行发酵生产的历史。由于古DNA能提供处于驯化历程中的古代发酵微生物的直接遗传信息，可作为直接证据佐证对过去的推断，并为分子钟提供必要的校准信息[10]，所以发酵微生物的古DNA研究对于阐述发酵历史有重要意义。尽管有关微生物的研究已不鲜见，但此前由于研究材料和技术的限制，尚未见基于古DNA的发酵微生物演化研究。当前，学界对微生物古DNA的研究主要集中于与人体共存的微生物上，包括人类致病微生物和与人类共生的微生物[10]。相比其他微生物，这些微生物与人类有最直接的联系。基于人类遗体、牙结石和粪化石等样本，研究者能获取并分析人体微生物古DNA[11～13]。这些样本具有致密的结构，能一定程度上将内部与外界环境相隔绝，为古DNA提供了较良好的保存环境[10]。相比之下，暴露在食品容器表面的发酵微生物古DNA更加难以保存。尽管如此，从考古遗存中获取发酵微生物古DNA是可能的，此前已有研究者试图从出土陶罐中获取酵母菌古rDNA[14]。古微生物技术特别是古DNA捕获技术的发展将帮助研究者获取并分析发酵微生物古基因组。

由此，本文基于现有考古学和基因组学报道，介绍了发酵食品历史和发酵微生物的驯化研究，以及古微生物学和发酵古微生物研究现状，并讨论了发酵微生物古DNA研究的必要性和可行性。

1 发酵食品考古

考古学研究为发酵食品的历史提供了实物证据，也成为发酵微生物演化研究的人文和社会背景。目前，对发酵食品的考古研究主要依赖于对作为食品容器的陶瓷制品的化学分析[15]。食物成品本身极难经历相当长的考古时期保存至今，但在古人加工和储存食物的过程中，食物内的有机物可以被无釉陶瓷器的多孔表面吸收，这些有机物及其降解产物可能因此保存下来[15～17]。在发酵食品中，酒精饮品和发酵乳制品又分别因其特别的文化意义和实用价值备受学者关注，其他种类的的发酵食品目前只有很少的研究报道[18,19]，暂不作讨论。

表1 现代发酵食品

在对发酵食品的考古研究中，酒尤受研究者重视。这不仅因为它拥有悠久的历史，还因为酒精具有的消毒、镇痛和精神改变作用，使酒精饮料有了超出一般食品的药用价值和文化意义[20]。在考古上，出土陶片中吸附的残留物可以用有机溶剂提取，并通过液相色谱和红外光谱等方法确定提取物的化学成分，从酒石酸等标记物的存在来确定酒的存在，再由残留物的化学组成结合遗址的植物遗存和气候条件推断出具体的发酵原料[16]。利用此方法，可以给出酒在历史上真实存在的实物证据。目前最早的酒精饮料的考古证据来自中国，是约公元前7000年由粮食和水果混合酿成的酒精饮料的遗存[2]；而最早的葡萄酒证据则是研究者在高加索地区发现的约公元前6000年的相关遗存[21]。酒在社会生活中的特殊角色也可以由考古发掘来阐述。在一项对古埃及陶罐样品的研究中，一系列天然草药成分从古酒残留物中被检出，表明这里的酒曾被制成药酒使用[22]。在西班牙地区的另一项研究中，古酒作为祭祀仪式的一部分，与多种祭器一起出土[23]。这两项残留物分析研究的结论也印证了当地古文献的相关记载。

乳酪和酸奶是另一类具有重要意义的发酵食品，不仅能以不易腐烂和可运输的形式保存动物乳，还能降低乳糖含量，使乳制品更易于乳糖不耐受人群的消化[24]。考古上对发酵乳制品的鉴别通常依赖于通过色谱等方法对出土容器上脂肪酸残留的鉴定，再结合对容器器型的鉴别。考古上多以此法证明发酵乳制品的实际存在，如安纳托利亚和克罗地亚地区的史前乳酪生产[3,24]。

考古研究致力于发掘发酵古食品的实物存在，并印证古文献的相关记载，但考古上对发酵古食品的鉴别多依赖于对食物降解后产生的标记物的鉴别，而且需要结合对遗址其他情况综合考量，常常难以获得古食品相关的直接证据。而近年来通过分子生物学方法的研究为此提供了新的思路，比如Yang等[25]通过蛋白质组分析鉴别了新疆小河遗址的有机物残余，鉴定出多种存在于乳制品和发酵微生物中的蛋白质及多肽，为古代乳酪生产提供了直接证据。此外，Cavalieri等[14]还通过古酵母DNA来鉴别古酒。DNA方法可以成为发酵古食品鉴别更直接的有力手段。

但是相关研究也带来了许多新的问题。从各地发掘的诸多古代遗存展示了发酵食品的古老存在，这些食物起源何处，如何演变和传播？古人如何利用微生物进行发酵生产，这些微生物又如何被驯化为今天的样子？这些问题将可能通过古DNA等分子进化方面的研究来进一步探讨。

2 现代发酵微生物的适应和驯化

基因组学研究揭示了人如何驯化微生物以获得适于生产的品系。在驯化过程中，人们选择和繁殖野生物种，以获得适于在人工环境中繁衍和生产。从自然界多变、复杂且常常十分严酷的环境到稳定而营养丰富的培育环境，生物适应新环境的过程在基因组中留下了典型的迹象，在生产环境中保留下了能使生物更适应人工生态位或人类生产需要的功能基因序列变异或者拷贝数变异[8,9]。这一标志为研究者通过基因组研究判断驯化行为提供了依据。本文讨论的发酵微生物并不是一个严格的分类学概念，而是用于发酵生产的微生物的总称，包括多种细菌、霉菌和酵母。下面通过生产酒精饮料和发酵乳制品的两类微生物——酿酒酵母(，含1个属，约16种)和乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB，大约有18个属，200多种)来讨论发酵微生物的驯化研究。

对现代酿酒酵母的基因组研究为其驯化和对工业生产环境的适应提供了重要见解。工业酿酒酵母基因组上主要表现出三类选择因素。一是人类生产需要的选择。Gallone等[26]发现多数工业酿酒酵母菌株的1和1基因突变丧失功能，使菌株失去了4-乙烯愈创木酚(4-Vinylguaiacol, 4-VG)生产能力，消除了产品中4-VG带来的异味。二是人工营养环境的选择。Marsit等[27]发现，相较于野生菌株，现代葡萄酒分离株具有的多拷贝的基因编码的寡肽转运蛋白使工业菌株能更好地利用葡萄汁中的丰富氮源。此外，现代啤酒分离株特有的基因也使工业菌株能利用麦芽汁所富含的麦芽三糖[26]。三是工业环境特有的生存压力的选择，例如对铜离子(存在于杀虫剂中，残留在作为酿酒原料的植物上)、亚硫酸盐和钴离子(防腐剂)的抵抗[28～30]。除变异并受选择外，现代酿酒酵母对工业生产环境的适应基因有一部分也来自于基因的水平转移。作为真核生物，酵母菌的杂交情况可以通过比较染色体结构和等位基因序列加以辨别[31]。Erny等[32]就依此在北欧一支酿酒酵母品系中发现了来自野生酵母的低温适应基因。上文所提及的基因也来自与环境菌株的杂交[27]。工业酵母对工业环境的适应基因也随其与野生酵母的杂交扩散到环境中[33]。

对现代乳酸菌的基因组研究也对其驯化过程带来了一些有意义的结论。乳酸乳球菌()是现代乳酸菌基因组研究中的模式物种，对乳酸乳球菌基因组的系统发育分析表明现代乳制品分离株是从植物分离株演化而来[34]。在演化过程中，乳酸乳球菌基因组上有多个糖苷利用基因簇丢失，这些基因簇在乳品生态位中可有可无，但对利用植物材料生长十分重要[35]。在现代乳品分离株中还发现了氨基酸生物合成和运输相关基因的功能增益突变。尽管相关机制还不清楚，但在实验室驯化模拟过程中，通过乳品培养的植物分离株里也发现了类似的突变，暗示这些基因的功能增益突变与乳品发酵环境适应有关[36]。此外，类似酿酒酵母，乳酸菌也表现出对如低pH值等生产环境特有因素的适应[37～39]。

尽管对发酵微生物的适应和驯化研究已取得许多成果，但基于现代基因组的研究仍有其局限性。一方面，基于现代基因组的研究对微生物的演化历程只能通过比较基因组学方法进行推断，难以获得直接证据；另一方面，基于现代样本研究菌株驯化的时间尺度较短，对于更早历史时期中发酵微生物的演化细节的复原能力较为有限。而对发酵微生物古DNA的研究可能是探究这些问题的有力手段。此外，结合考古学及古人类基因组学证据，复原古发酵微生物的演化历史还可能有利于更深入地理解人类历史中与发酵相关的生活和饮食习惯的变迁(如对牛、羊等产乳、产肉动物的驯化)，以及不同人群及相关文化技术的交流等。

3 微生物古DNA与发酵古微生物

利用古DNA重建古代基因组是获取古生物遗传信息的有效方法。而古DNA本身是从古代材料中获得的DNA分子。在材料的埋藏过程中，古DNA分子会随时间的推移而不断降解，外在环境以及材料与研究者的交互也会引入外源污染DNA。因此，样本中的内源DNA比例通常很低，DNA分子高度碎片化(通常平均小于100 bp)，同时序列上会存在脱氨基和脱嘌呤损伤[40～42]。古DNA分子的常见损伤是片段末尾单链粘性末端的胞嘧啶的脱氨基。胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶，扩增过程中被识别为胸腺嘧啶从而导致碱基转换，这也成为鉴别古DNA的重要特征[43,44]。结合古DNA和基因组学等手段，可以获取古代样本中微生物的遗传信息，从而了解样本中微生物的组成以及这些古代微生物的遗传特点，了解其系统发育关系及演化历史。

3.1 古微生物研究的机遇和挑战

古DNA可以揭示早期微生物的演化历程。不同于动物和植物，微生物的演化难以通过化石记录进行研究，古DNA就成了研究历史时期中微生物演化的有效手段。在此前的研究中，多种微生物的古基因组已成功重建，鼠疫耶尔森菌()等几种与人密切相关的微生物在人群中传播和演化的历史得到进一步阐述[45～49]。相比于现代样本，古DNA对进化研究的贡献还在于它能够用直接证据佐证对过去的推断，有时甚至能提出不同于仅基于现代样本的演化分析的新证据。例如，现代欧洲和南美洲结核分枝杆菌()基因组的同源性和共同祖先时间推断支持肺结核由欧洲殖民者带到南美洲的观点，但基于古DNA的研究提供了结核分枝杆菌更早传入南美洲的证据[45]。此外，古代和现代菌株的差异还可能揭示一些和工业化相关的演化事件，比如Adler等[50]观察到的工业革命前后人类饮食结构变化导致的口腔微生物群落变化。古微生物DNA的研究虽然目前还基本局限于对与人共生的古微生物的分析，但无疑为微生物演化研究提供了新的方向，也启示人们以新的思路和方法进一步阐述发酵微生物的演化和驯化问题。

古微生物研究也存在其特有的挑战。在考古样品埋藏的长期历史过程中，来自环境微生物的DNA与内源DNA混合在一起。由于许多内源微生物与环境微生物属于同一属，内源DNA与外源污染可能难以区分[51,52]。为克服这一问题，可以尝试对DNA损伤模式进行鉴别，即通过脱氨基导致的碱基转换来鉴别古DNA的特征[53]。比如广泛应用于古DNA领域的mapDamage软件可以提供比对后的碱基错配情况用以鉴定样本中是否存在古DNA[54]。然而碱基错配需要将DNA比对至目标基因组，用于评估包含多种已知和未知微生物的古代样本中的古DNA情况存在局限性。目前已有工具将古样本中的微生物种群鉴定及对应DNA损伤评估进行结合[55]，但对于尚无参考基因组的古DNA尚无有效鉴定方案。

此外，古微生物学面临的另一个挑战是如何真实地评估样本中的古微生物群落。在环境发生改变后，微生物组的平衡会迅速改变，这可能导致关于古代微生物群落的错误结论[56]。不同微生物的DNA在样本中保存情况的差异也可能影响研究结果[56]。目前，对于上述因素如何影响对古微生物群落的重建仍鲜有研究。基于牙石样本，Ziesemer等[57]研究了16S rDNA中V3区域的系统性扩增偏差对人口腔古微生物组的重建的影响。要进一步减轻上述问题导致的数据偏差，未来还需要对各种因素影响进行系统性评估。

3.2 发酵古微生物研究的现状和未来

2003年，Cavalieri等[14]从一个古埃及墓葬出土的陶罐中成功获取了来自酿酒酵母的古DNA片段。自然条件下，酿酒酵母罕见于植物表面以外的环境中，且不在人类皮肤表面生存，这也在一定程度上减少了外源污染的影响。Cavalieri等[14]比较了古代和现代酿酒酵母菌株的DNA序列，建立了最大似然树，但受限于他们只得到了较为完整的核糖体DNA，这部分研究最后只作为古埃及人利用酵母酿酒的分子生物学证明，而且由于当时对古DNA特征认识较为有限，也尚未建立系统而严谨的古DNA鉴别流程，此研究存在一些局限性。

目前而言，部分保存良好的古发酵制品，比如古干酪或者古酒等，可能作为发酵微生物古DNA的潜在来源；另外，由于食物残留可能被吸收到陶瓷容器上，食品容器也可能成为古DNA的来源[14,17]。可用于遗传研究的古DNA样本来源稀少是目前发酵古微生物研究发展最重要的限制因素。此前报道的微生物古基因组大多来源于骨骼和牙结石等样本，这些样本结构相对致密，内部在一定程度上与外界环境相隔绝，能为DNA提供相对较好的保存环境[10]。而环境古微生物也大多来自DNA保存条件相对较好的永冻区冰层，其中包括了Bidle等[58]获得的迄今最古老的细菌遗传证据。相较而言，发酵制品常常很快在环境中降解，在漫长的历史时期中无法为古DNA保存提供有利环境。因此，未来除了对保存较好的发酵品进行微生物研究外，也可以尝试在有利于古DNA保存的环境(如寒冷干燥的地区)中发掘的、有考古学证据支持的古代食品容器中的残留物上进行发酵微生物的DNA捕获，从而拓展古微生物研究可用的材料范围。

古DNA捕获技术的发展可能是环境古DNA研究发展的重要技术突破。该技术基于DNA序列的碱基互补配对原则，利用探针从提取的总DNA文库中捕获目标DNA片段[59]。早前，Burbano等[60,61]和Avila-Arcos等[62]的研究表明可以通过碱基互补配对来获取古代样本中的DNA，但当时他们的捕获方法效率还相对较低。DNA捕获技术在经过改进后应用于古人类样本中，从内源DNA含量低于0.03%的古人类样本中，将目标序列比例富集至超过46%[59]。这一技术进步极大提高了样本的内源DNA的比例，使保存情况更差的样本中的古DNA获取成为可能。通过这一方法，Viviane等[63]从欧洲和西伯利亚洞穴的土壤样品成功捕获了古人类线粒体基因组，并用于构建系统进化树。相比于动物，微生物的细胞结构以及其膜上特有的糖苷醚脂和霍帕烷等成分都使其DNA更易于在环境中保存[56,64,65]，另外微生物基因组常常只有几百万碱基对，只有动物基因组大小的千分之一，因此能以较低数量的探针达到高深度覆盖全基因组的需求。这些都是获取发酵微生物古DNA的有利条件。将古DNA捕获技术应用于环境古微生物研究，有望为发酵古微生物演化和驯化研究带来新的分子证据。

因此，使用古DNA捕获技术从发酵食物遗存中获取相关发酵微生物古基因组，以进行遗传分析，有潜力为发酵古微生物演化研究提供更多新证据和见解。结合古DNA实验技术和现代发酵微生物研究手段，本文提出以下发酵古微生物研究流程的基本框架(图1)：(1)从考古遗址中获得合适的材料，发酵食品或者食品容器遗存可能是合适的材料选择；(2)从材料中提取全部DNA，并加上特异性接头；(3)根据目标微生物DNA序列特征设计并制备特异性探针，连接到磁珠上；(4)将提取的总DNA与探针混合，因为基于碱基互补配对原则，目的DNA更容易与探针结合，所以目的DNA可以由此被杂交捕获，进而得到富集；(5)吸附磁珠，更换溶液将被捕获的目的DNA洗脱下来，得到富集的目的DNA文库；(6)高通量测序；(7)数据质量控制，比如对古DNA的鉴定以及对遗传数据污染情况的估计等；(8)后续遗传分析，比如系统发育和基因功能演化等。

图1 基于古DNA捕获技术的发酵古微生物演化研究流程基本框架

流程方案基于古DNA捕获技术设计：a)从发酵食品或其容器遗存中提取DNA；b)依据目标微生物基因组设计探针并杂交捕获，达到富集目的DNA的效果；c)随后进行高通量测序和遗传数据分析。

目标微生物的基因组(比如该种微生物特有的基因序列)可以作为参考序列来设计DNA捕获探针[46]。得到遗传数据之后，可以通过碱基错配等DNA损伤情况来鉴别古DNA[43,44]。捕获得到的发酵微生物古基因组可能用以讨论和解答相关的科学问题。一是发酵食品及发酵微生物来源和传播的问题。在系统发育分析上，古代样本可用以校正分子钟，样本的时间通常可以由同位素测年法确定[10,25]。微生物的系统发育树通常由最大似然法或者贝叶斯法建立，并使用贝叶斯树推测各分支最近的共同祖先的时间[45～49]，进而可能讨论发酵微生物的可能起源以及和其他现代发酵微生物的系统发育关系。二是发酵微生物功能演化的问题。相较于现代样本，古代样本可能更直接地展示发酵微生物更久远的演化历程。与动植物不同，微生物常常存在广泛的水平基因转移[27,31～33]。因此，古代和现代微生物基因组上功能基因的变化可能一定程度地反应它们经历的环境变化和选择压力[26～30,37～39]。然而，受限于DNA污染和损伤，目前古代DNA片段主要依赖于和参考基因组的比对，而鲜有从头组装。因此，古代微生物基因组的功能基因的差异分析主要局限于它们和现代微生物相比缺失的基因，且这些缺失片段需要谨慎确认并非来自DNA损伤和数据缺失。另外，还有一些古微生物研究比较古代和现代微生物基因组在功能基因上出现的突变来推测其功能的变化，如发生无义突变而形成的假基因等[47～49]。

4 结语和展望

发酵食品在世界许多地方都是重要而古老的一类食物，其时间和空间上的广泛分布已由考古发掘所证明，古代遗存也能用来追溯发酵食品的原始形态。然而，发酵食品怎样起源、演变，以及作为发酵活动关键的微生物又是如何随着人类活动被驯化和传播的？这些问题驱使着人们以基因组学方法来进一步回答。

基于现代菌种的基因组学研究业已取得许多成果，但在复原发酵微生物的驯化历史细节上仍存在一些局限性。古DNA技术是研究古微生物的重要手段，结合考古学和古基因组学证据，古微生物DNA信息将有助于为发酵微生物的演化历史提供额外证据。

随着二代测序技术的广泛应用，古DNA领域在过去十年迅速发展，相关的古DNA实验技术也在不断开发和优化。古DNA捕获技术已成功从含量极低的样本中捕获目标古DNA，包括从沉积物中捕获古老型人类DNA和从古代骨骸样本中捕获病原微生物DNA等[46,49,63]。尽管材料稀缺且DNA保存情况不一，高效的古DNA捕获技术使从考古遗存中获取足够完整的发酵微生物古基因组并重建其演化历史成为可能。在不久的未来，古DNA方法将有助于进一步阐明发酵微生物的演化和驯化历史，为相关的科学问题带来新的突破。

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Exploration of adaptation, evolution and domestication of fermentation microorganisms by applying ancient DNA technology

Zequan Zheng1,2,3, Qiaomei Fu1,2,3, Yichen Liu1

Fermentation production is the most primitive application of microorganisms by humans, which is of great significance in human history. However, due to the lack of molecular evidence, the history of human fermentation production and the evolution and domestication of fermentation microorganisms remain to be further investigated. Taking wine and fermented dairy, the two most common types of fermented foods as examples, we introduce the archaeology evidence of fermented foods and the evolution and domestication of fermented microorganisms, introduce the research status of paleomicrobiology and fermented paleomicroorganisms, and explore the feasibility and challenges of the research of ancient fermented microorganisms applying microbial ancient DNA technology, as well as the application potential of ancient DNA capture technology in this field.

fermentation; microorganism; ancient DNA; evolution

2022-03-06;

2022-04-10;

2022-04-19

国家自然科学基金项目(编号：41925009)，中国科学院及财政部基金项目(编号：YSBR-019，XDB26000000)资助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 41925009), Chinese Academy of Sciences， and the Ministry of Finance of the People's Republic of China (Nos. YSBR-019, XDB26000000)]

郑泽权，在读硕士研究生，专业方向：古基因组学。E-mail: zhengzequqn18@mails.ucas.ac.cn

刘逸宸，博士，研究方向：古基因组学和古微生物学。E-mail: yichen.liu@ivpp.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-057

(责任编委: 谢建平)