槟榔根腐病菌拮抗菌株的筛选与鉴定

刘双龙，杨德洁，牛晓庆，杨福孙，覃伟权

（1.海南大学 热带作物学院，海口 570228; 2.中国热带农业科学院 椰子研究所/海南省院士创新平台/海南省槟榔产业工程研究中心，海南文昌，571339）

槟榔(Areca catechuL.)属于棕榈科多年生常绿乔木，性喜高温高湿[1]，是我国四大南药之一，在我国海南、广东、台湾、云南均有种植[2]。随着槟榔种植面积的逐年增加，病虫害频发，槟榔根腐病为槟榔的典型根部病害，对槟榔的健康生长具有较为严重的影响，李增平等[3]的研究发现，海南省槟榔主产区万宁、陵水等地的部分黄化及枯死槟榔是由根腐病导致的。尖孢镰刀菌（F.oxysporum）是槟榔根腐病病原的1种病菌，常侵染槟榔根、茎基部，导致侵染部位坏死腐烂，从而导致槟榔的叶片变黄，整体长势变差；此侵染在高温、高湿条件下极易发生[4]。有文献表明，可可毛色二孢菌可感染桑树根部引起桑树根腐病[5]；奇异根串珠霉菌能侵染槟榔茎干，导致槟榔茎泻血病[3]。目前对尖孢镰刀菌、可可毛色二孢菌、奇异根串珠霉菌的防治多集中为化学药剂的筛选。戴利铭等[6]通过菌丝生长速率法测定了10种杀菌剂对病原菌的毒力，发现多菌灵对可可毛色二孢菌的防治效果最好。熊明国[7]采用生长速率法测定了6种药剂对尖孢镰刀菌的毒力，发现甲基硫菌灵对尖孢镰刀菌的防治最好。余凤玉等[8]采用生长速率法和孢子萌发抑制法，测定了10种药剂对奇异根串珠霉菌的抑制作用，发现对菌丝和分生孢子芽管生长有较强抑制作用的是多菌灵、异菌脲和甲基硫菌灵。虽然化学防治具有见效快、生产成本低等优点，但其也存在易使致病菌产生抗药性，易使有益微生物数量骤减和减弱土壤自身的修复能力等问题[9]，实施生物防治是解决这些问题的首要选择，对槟榔产业的可持续发展具有重要的意义。关于尖孢镰刀菌、可可毛色二孢菌、奇异根串珠霉菌等3种病原菌的生物防治，谢红辉等[10]的研究结果发现，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）对可可毛色二孢菌的抑菌率达73.3%；牛晓庆等[11]的研究结果发现，浅灰链霉菌（Streptomyces griseolus）对奇异根串珠霉菌有较强的抑制作用。王宇鹏等[12]筛选到1株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis），并发现其对尖孢镰刀菌具有较强的抑制作用。目前，关于尖孢镰刀菌、可可毛色二孢菌、奇异根串珠霉菌等3种病原菌的拮抗菌株大多处于实验室阶段，其中有效生防菌株匮乏。为了丰富槟榔根部尖孢镰刀菌、可可毛色二孢菌、奇异根串珠霉菌等3种病原菌的生防菌资源，本研究通过对发病槟榔园的健康槟榔的根内生细菌和根部土壤中的细菌（根部土细菌）进行分离，采用平板对峙法进行生防菌株的筛选，并测定生防菌液对尖孢镰刀菌、可可毛色二孢菌、奇异根串珠霉菌等3种病原菌的抑制作用，同时验证其对发病植株的防治效果，最后对生防菌的培养条件进行优化，以期为槟榔根部病害生防菌剂的开发提供菌种及防治方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试材料供试样本采自海南发病槟榔园健康植株的根和根部土壤，每个样品3次重复。并立即用聚乙烯无菌袋密封，用冰盒带回实验室进行处理。供试槟榔根部病原菌Q-7-1可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）、F-2 尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和TP-11奇异根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）由笔者所在的实验室分离保存。实验用槟榔苗“热研1号”来自热科院椰子研究所基地。

1.1.2 供试培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、细菌基础培养基（LB）、牛肉膏酵母葡萄糖培养基（NYBD）、营养琼脂培养基（NA）、豆芽汁培养基，以上培养基按常规方法配置[13−14]。

1.2 拮抗菌的分离、筛选及鉴定

1.2.1 样品细菌的分离纯化采用平板稀释梯度培养法[15]和组织匀浆法[16]分别对根部土细菌及根内生细菌进行分离、纯化。

1.2.2 拮抗细菌的筛选采用平板对峙法进行拮抗细菌筛选。拮抗细菌使用NA培养基培养，对峙实验及病原菌培养采用PDA培养基。以不放置细菌菌块的 PDA 平板为对照，于 28 ℃ 培养 2 d后测量细菌及病原菌2个接种点连线上病原菌的菌落半径（mm），计算抑菌率[17−18]。初筛以可可毛色二孢菌为靶标，对初筛具有较好拮抗作用的菌株，以尖孢镰刀菌和奇异根串珠霉菌为靶标进行验证，以期得到对尖孢镰刀菌、可可毛色二孢菌、奇异根串珠霉菌等3种根腐病菌综合拮抗作用最好的生防菌株。

1.2.3 拮抗菌种子液的制备及其对3种病原菌的抑制作用挑取拮抗菌株单菌落于装有100 mL LB 液体培养基的250 mL锥形瓶中，置于恒温摇床中，28 ℃、180 r·min−1振荡培养 24 h 作为种子液备用，并测量菌液在波长为 600 nm 时的OD值。采用滤纸片抑菌测定法进行菌液抑菌作用测定。具体操作：在超净工作台中将无菌滤纸片在拮抗菌液中浸泡 30 s。用无菌镊子夹取滤纸片，淋掉多余液体，使滤纸片与培养基密切接触。每个培养基上均匀放置3张滤纸片，以只接LB的滤纸片培养基为对照，进行对峙实验（方法同1.2.2）。

1.3 拮抗细菌的鉴定对槟榔根腐病具有拮抗作用的菌株，接种于NA平板培养基上，32 ℃培养24 h，观察菌落的形态、大小、边缘、透明度等形态特征，并采用青岛海博生物有限公司生产的生化试验配套试剂进行菌株的生理生化特性检测，检测方法参照说明书进行，参照《常见细菌系统鉴定手册》[19]从形态特征对菌株进行生物学鉴定；再结合 16S rDNA基因进行分子学鉴定，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取拮抗菌的DNA，以拮抗菌株的基因组DNA为模板，采用细菌通用引物27F： 5 ′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′/1492R：5 ′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'进 行 PCR 扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序；对测序结果进行BLAST同源性比对，并从GenBank数据库获得相关菌株的 16S rDNA 序列，在MEGA7.0 上用Neighbor−joining分析法构建系统发育进化树[20]。

1.4 拮抗菌最佳培养基组分的配比对碳源、氮源及无机盐的筛选参照何明川[13]杨亚男[14]的方法以豆芽汁为基础培养基，分别加入 2%的麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉进行最佳碳源的筛选；分别加入1%的氯化铵、酵母浸粉、牛肉膏、甘氨酸和蛋白胨进行最佳氮源的筛选；分别加入0.3%的七水合硫酸镁（MgSO4· 7H2O）、碳酸钙（CaCO3）、磷酸二氢钾（KH2PO4）和磷酸氢二钾（K2HPO4）进行最佳无机盐的筛选。每组 3次重复，测量菌液在波长为 600 nm 时的OD值。根据上述碳源、氮源及无机盐的单因素试验结果，设置3因素3水平正交试验，对其最佳用量进行优化，以确定最佳培养基组分配方。

1.5 室内防效测定

1.5.1 拮抗菌株悬浮液的制备挑取拮抗菌株单菌落于装有 100 mL NYBD 液体培养基的 250 mL锥形瓶中，置于恒温摇床中，28 ℃、180 r·min−1振荡培养 24 h后得到拮抗菌菌悬液，调节浓度至约为 109CFU·mL−1。

1.5.2 盆栽实验选取长势基本一致的“热研1号”槟榔苗，移栽至装有1∶1的灭菌土和蛭石的花盆中，缓苗15 d左右，采用伤根灌注法[21]，向实验组和对照组每盆分别接种孢子浓度为107CFU·mL−1的可可毛色二孢菌孢子液200 mL，接种病原菌10 d后，选择对峙实验结果中拮抗效果最好的菌株进行灌根处理，每株苗接种拮抗菌液200 mL，菌液浓度为 109CFU·mL−1，同时对照组每株淋入无菌NYBD培养基200 mL。每组5个重复。定期观察槟榔幼苗感病与生长情况，计算幼苗发病率[22]。

1.6 数据分析采用 IBM SPSS Statistics Version 22.0进行单因素方差分析，并且使用Duncan法进行显著性检验（P＜0.05），使用 GraphPad prim 完成实验数据作图。

2 实验结果

2.1 样本拮抗菌的分离、筛选结果从各样本中共分离到 247 株细菌。通过平板对峙实验筛选到6株细菌对可可毛色二孢菌具有拮抗作用，且 6株拮抗菌的抑菌率均达到 60%以上（表1）。从中选取3株拮抗效果好的菌株brj-21、qrj-2-6和wrb-2-4。从这3株拮抗菌中筛选出对槟榔其他2种根腐病原菌也具有较强抑制作用的菌株，得到菌株brj-21对可可毛色二孢菌、尖孢镰刀菌和奇异根串珠霉菌拮抗效果均较好，抑菌率分别为73.66%、68.00%和74.33%，抑菌带宽分别为6.50 、4.83 、5.83 mm；并发现 brj-21 菌液（OD600值为2.84）也对槟榔3种病原均有较强的抑菌能力。这表明brj-21菌株对3种槟榔根部病原菌的防治有较好的生防潜力（表2、3，图1）。

表1 对可可毛色二孢菌具有抑菌作用的菌株

表2 3株生防菌对尖孢镰刀菌和奇异根串珠霉菌的抑菌作用

表3 brj-21 菌液对病原真菌的抑菌作用

2.2 拮抗菌株的鉴定

2.2.1 生物学鉴定将菌株 brj-21 接种至 NA 培养基上，32 ℃ 培养 24 h 后生长良好，菌落初期成乳白色，边缘较为规则，表面平滑、干燥，菌株为革兰氏阴性菌（图2）。不能水解明胶、淀粉，不能利用甘露醇、硫化氢，硝酸盐还原反应为阳性等，对照《常见细菌系统鉴定手册》，初步将此菌株归为产碱菌属Alcaligenes sp.（表4）。

表4 生防菌株 brj-21 的生理生化特性

2.2.2 分子学鉴定由 16S rDNA 测序表明，扩增后的菌株brj-21序列长度为1 440 bp，经过与NCBI的 GenBank 数据库比对，发现与粪产碱菌（Alcaligenes faecalis，登录号是 MH 106702.1）的相似度达到 99%，此外下载8个产碱属不同种的菌株序列，并选择肠杆菌（Escherichia coli，登录号是NZ FAVL01000094）作为外群菌株，通过 MEGA 7.0构建系统发育进化树。发现菌株brj-21与粪产碱菌（Alcaligenes faecalis，登录号是MH 106702.1）处于同一分支上，并综合菌株形态和生理生化特征，鉴定 brj-21 菌株为Alcaligenes faecalis（图3、4）。

2.3 发酵条件优化结果

2.3.1 不同碳源对菌株brj-21生长的影响菌株brj-21在5种碳源中皆可以生长，但当以葡萄糖为菌株brj-21碳源时，拮抗菌生长最佳，菌液OD值高达2.95。故菌株brj-21的最佳碳源是葡萄糖（图5）。

2.3.2 不同氮源对菌株brj-21生长的影响菌株brj-21在5种氮源中皆可以生长，当以酵母浸粉为菌株brj-21氮源时，拮抗菌的生长最佳，菌液OD值高达2.79。故选择酵母浸粉为菌株最佳氮源（图6）。

2.3.3 不同无机盐对菌株brj-21生长的影响菌株brj-21在4种无机盐中均可以生长，当以七水合硫酸镁为菌株brj-21无机盐时，拮抗菌的生长最佳，菌液OD值高达2.92。故选择七水合硫酸镁作为菌株最佳无机盐（图7）。

2.3.4 菌株brj-21培养基组分正交试验结果以葡萄糖、酵母浸粉和七水合硫酸镁为因素的正交试验结果见表5。由表5中R的大小排列得出，影响菌株brj-21生长的最主要因素是葡萄糖，其次是酵母浸粉，影响最小的是七水合硫酸镁。根据表5中K值的大小，得出最佳培养基水平组合为2.5%的葡萄糖、1%的酵母浸粉、0.4%的七水合硫酸镁，即优化培养基配方为葡萄糖2.5 g、酵母浸粉 1 g、七水合硫酸镁 0.4 g，水 100 mL。

表5 brj-21 正交试验分析

2.4 盆栽实验通过对盆栽槟榔苗生长发病的情况进行观察记录，根据40 d后的发病情况发现，对照组有3株植株叶片叶尖首先发黄随后干枯，主根维管束发黑腐烂，长势普遍较弱，最后整株枯死，发病率为60%。实验组幼苗整体长势较好，对照组和实验组植株差异较大。说明菌株brj-21对可可毛色二孢菌引起的根腐病具有较好防病效果（图8）。

3 讨 论

本实验筛选到的生防菌株brj-21为槟榔根内生菌。内生菌（Endophyte）是指其生活史的一定阶段或全部阶段定殖于植物器官、组织内部以及细胞间隙的微生物[23]。内生菌与植物的生长息息相关，其作为潜在生防资源和外援基因载体在农业生产中的应用具有广阔的前景，已成为农业专家研究的焦点[24]。槟榔根腐病是槟榔极易发生的病害，主要以叶尖变黄、根茎腐烂变色为主，是由多种病原等引起的真菌性病害[3]。生物防治具有不污染环境，不易使病害产生抗药性及对非靶标生物安全等优点，以被广泛应用[25]。常见的生防菌株有放线菌属、芽孢杆菌属和假单胞菌属等。关于粪产碱菌为生防菌株的报道较少，但已有报道粪产碱菌可产生羟胺类物质而抑制成团泛菌和多种植物病原真菌的生长及降解多种有毒有害物质如苯酚、氰化物、亚砷酸盐、硫化氢等[26]。高之蕾等[27]的研究结果表明，粪产碱菌51-A和51-B对桃树根癌病具有较强的抑制作用。Yuen等[28]的研究结果发现, 该菌在与尖孢镰刀菌 (F.oxysporum) 作用过程中可以产生一种铁螯合剂，能够抑制尖孢镰刀菌的生长。本研究从健康槟榔根中分离、筛选到的内生粪产碱菌brj-21对可可毛色二孢菌、尖孢镰刀菌和奇异根串珠霉菌均具有较强的抑菌作用，说明brj-21可作为生防菌株。

在外界营养和发酵均适宜的条件下，brj-21产生的抑菌物质一般更丰富。有研究[29]表明由粪产碱菌的毒理学试验结果得出该菌株是安全的，可以作为微生物肥料生产用的菌种，那么，对菌株进行培养条件的优化显得愈发重要。本实验采用单因素与正交实验得出菌株brj-21优化培养基配方为酵母浸粉 2.5 g、葡萄糖 1 g、七水合硫酸镁 0.4 g、水100 mL。蒋樟丽等[30]对粪产碱菌AF01的优化中，菌株AF01生长的最佳碳源是蔗糖。2株菌碳源的差异可能是由于菌株用途、来源、生境等不同造成的，后续应再次验证。本研究只对拮抗菌株的室内实验做了初步探索，结果发现菌株brj-21对由可可毛色二孢菌导致的根腐病有较好的防病效果。验证菌株brj-21对尖孢镰刀菌和奇异根串珠霉菌导致的槟榔根腐病的防病效果及大田实验有待后续重点研究。

本研究筛选到的菌株brj-21对槟榔根腐病的尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）和奇异根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）3种病原均具有较强的抑制作用。brj-21经鉴定为粪产碱菌，并对其最适培养基组分进行优化，以期为利用菌株brj-21对槟榔根部病害的生物防治提供菌种及理论指导。