黄芪多糖对放射性皮炎小鼠炎性因子和生长因子的影响

张国荣，张亚奇，尉志民，张建萍，周燕*

(1.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000；2.天水市第二人民医院，甘肃 天水 741020)

放疗是癌症治疗的重要手段之一，但高达95%的放疗患者可发生放射性皮炎的并发症，其症状多以瘙痒、疼痛等为主，严重影响患者治疗期间和治疗后的生活质量[1]。目前，常规治疗药物三乙醇胺乳膏作用较为局限[2]，研究表明，中医药在治疗放射性皮炎方面疗效较好[3]。黄芪有“疮家要药”之称，实验和临床证据表明，黄芪的主要成分黄芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)可有效改善皮肤血液循环，增强局部抗病能力，促进局部病灶愈合，因此在临床上常被用于荨麻疹、老年性皮肤瘙痒、烫伤、湿疹等皮肤病的治疗[4]。课题组前期研究发现，黄芪可有效抵御放射性皮炎，本研究通过建立放射性皮炎小鼠模型探讨黄芪多糖防御放射性皮炎的分子机制，以期为临床治疗提供理论基础。

1 材料

1.1 实验动物

健康清洁级昆明小鼠，雄性，体质量18～22 g，由兰州大学实验动物中心提供，动物许可证书号：SCXK(Gan)2019-0723，动物合格证号：62001000002146，动物饲养于室温(23±2)℃、相对湿度(50±5)% ，水、食自由摄取，适应性喂养1周，所有小鼠实验均按照动物保护法进行，并经兰州大学第一医院伦理委员会批准。

1.2 试药与仪器

药物与试剂：三乙醇胺乳膏(法国Johnson公司，批号：20120425)，黄芪多糖(西安明泽生物科技有限公司，纯度>90%，批号：89250-26-0)；水合氯醛注射液(北京雷根生物技术有限公司，批号：20186739)，HE染色试剂盒(上海尚宝生物科技有限公司，批号：R23261)，TNF-α、IL-6、bFGF、VEGF、EGF试剂盒均采购自武汉赛培生物公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝有限公司，批号：20192452)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(北京索莱宝有限公司，批号：20191135)，二抗抗兔(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：123721)，ECL显色试剂(美国Millipore公司，批号：18428671)。

仪器：Unique型直线加速器(美国VARIAN医疗设备有限公司)，Q550CW图像信号采集与分析系统(德国制造)。

2 方法

2.1 放射性皮炎动物模型的建立

使用10%水合氯醛水溶液麻醉小鼠，8% Na2S溶液对小鼠背部皮肤脱毛，面积约4 cm×4 cm。用Varian加速器(SL-1800型)，6 MeV电子线，吸收计量率400 cGY·min-1，吸收剂量40 GY，每天照射1次，连续照射5 d[5]。

2.2 给药与分组

昆明种小鼠共80只，共分为4组，每组20只，分别为正常组、模型组、黄芪多糖组和三乙醇胺乳膏组，黄芪多糖组和三乙醇胺乳膏组每日9∶00、14∶00、19∶00各涂药1次，每次涂药量以均匀覆盖创面为宜，用药期间每天观察、记录病变情况。

2.3 疗效评定标准

记录创面愈合情况，创面的测量：分别于第1周、第2周、第3周用标尺测量创面，拍摄各组创面后使用image Pro Plus6.0软件分析创面面积，计算创面面积大小。创面愈合率：采用纸片增重法进行评价，即在创面贴透明薄纸后勾勒出创面形状，再将质地均匀的硬纸板依所勾勒透明薄纸形状和大小准确裁剪，然后将所裁纸板称重，记录质量。如用药第1天，纸片重为G1，用药第1周(7 d)，纸片重为G7，则创面愈合率H%=(G1-G7)/G1×100%，愈合率越大，疗效越好[6]。治疗3周后采用HE染色观察皮肤病理变化，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平，qPCR和蛋白印迹法(Western blot)检测皮肤组织中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)水平。bFGF、VEGF、EGF引物序列见表1。

表1 bFGF、VEGF、EGF引物序列

2.4 统计学分析

3 结果

3.1 小鼠创面的愈合情况

治疗1周后，三乙醇胺乳膏组小鼠创面愈合率高于模型组(P<0.05)，差异有统计学意义；治疗2周和3周后，黄芪多糖组、三乙醇胺乳膏组小鼠创面愈合率高于模型组(P<0.05)，差异均有统计学意义；黄芪多糖组与三乙醇胺乳膏组小鼠创面愈合率相比，差异无统计学意义，见图1、表2。

图1 第3周时各组小鼠创面的愈合情况

表2 各组小鼠创面愈合率情况

3.2 小鼠创面病理组织学情况

HE染色结果显示，模型组表皮角化，部分表皮内水泡形成，真皮充血水肿，可见淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润及大量损伤细胞；黄芪多糖组、三乙醇胺乳膏组表皮角化降低，损伤程度明显改善，创面组织修复程度优于模型组，见图2。

图2 第3周时各组小鼠创面病理组织学变化(HE，×200)

3.3 小鼠血清中TNF-α和IL-6水平变化

与正常小鼠相比，第3周模型组小鼠血清TNF-α、IL-6水平显著升高(P<0.05)；与模型小鼠相比，黄芪多糖组和三乙醇胺乳膏组小鼠血清TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.05)；黄芪多糖组与三乙醇胺乳膏组小鼠血清TNF-α、IL-6水平无明显变化(P>0.05)，见表3。

表3 各组小鼠血清TNF-α、IL-6水平情况

3.4 PCR检测皮肤组织中bFGF、VEGF、EGF mRNA水平变化

与正常组相比，第3周模型组、黄芪多糖组和三乙醇胺乳膏组小鼠bFGF、VEGF、EGF mRNA水平显著升高(P<0.05)，差异有统计学意义；与模型组相比，黄芪多糖组和三乙醇胺乳膏组小鼠血清bFGF、VEGF、EGF mRNA水平显著降低(P<0.05)，差异有统计学意义；黄芪多糖组与三乙醇胺乳膏组小鼠皮肤组织中bFGF、VEGF、EGF mRNA水平相比，差异无统计学意义，见表4。

表4 各组小鼠皮肤组织中bFGF、VEGF、EGF mRNA表达情况

3.5 蛋白印迹法检测皮肤组织中bFGF、VEGF、EGF蛋白水平变化

与正常组相比，第3周模型组小鼠bFGF、VEGF、EGF蛋白水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，黄芪多糖组和三乙醇胺乳膏组小鼠血清bFGF、VEGF、EGF水平显著降低(P<0.05)；黄芪多糖组与三乙醇胺乳膏组小鼠皮肤组织中bFGF、VEGF、EGF蛋白水平相比，差异无统计学意义，见表5。

表5 各组小鼠皮肤组织中bFGF、VEGF、EGF蛋白表达水平情况

4 讨论

放射性皮炎是由于放射线照射引起的皮肤黏膜炎症性损害，其中以X射线、γ射线最常见，其临床表现为皮肤干燥、瘙痒、烧灼感，久之皮肤色素沉着，出现水疱、皮肤溃烂等。本病作为恶性肿瘤常见的并发症，对患者的生活质量造成严重影响，严重者甚至会迫使患者中断放疗。

TNF-α、IL-6是与炎症有关的常见因子，有学者认为，放射性皮炎的分子学机制主要包括诱导急性和慢性炎症反应，本研究结果显示，在治疗3周后，黄芪多糖组小鼠血清TNF-α、IL-6水平显著降低，这可能与黄芪多糖改善小鼠表皮组织角化，减轻真皮充血水肿，抑制大量炎症因子的释放，细胞浸润有关，本研究HE染色也证实了这一点；另有学者段紫钰等[7]通过建立大鼠放射性皮炎模型，使用双草油涂抹照射皮肤局部，第14天时，ELISA检测血清中TNF-α、IL-6水平明显低于模型组(P<0.05)，与三乙醇胺乳膏效果一致。临床研究显示，在60例Ⅱ～Ⅲ放射性皮炎的颈胸部恶性肿瘤患者，在使用放肤膏治疗后患者血清IL-6水平显著下降，同时皮肤湿性渗液减轻、水肿消退，疼痛和痒感消退时间缩短[8]。此外，TNF-α、IL-6在特应性皮炎、接触性皮炎等皮肤病中也有表达[9-10]。

bFGF是一种肝素结合生长因子，其主要作用是促进包括间叶细胞、神经外胚层和血管内皮细胞在内的一系列细胞的增殖，其在体内还具有潜在的促血管生成活性[11]；VEGF是一种强有力的生长和血管生成细胞因子，刺激内皮细胞增殖和存活，促进血管生成和血管通透性[12]；EGF生长因子是人体内本身存在的一种活性物质，它能刺激表皮细胞生长因子，促进受损皮肤的修复与再生，促进创面、伤口加速愈合[13]；本研究结果显示，第3周时黄芪多糖组、三乙醇胺乳膏组小鼠皮肤组织中bFGF、VEGF、EGF mRNA水平和蛋白水平均降低，但仍高于正常组；在大鼠II度放射性皮炎模型的实验中，使用芦荟凝胶涂抹照射创面区，免疫组化检测结果显示，实验组和对照组从第2天至第24天创面组织中VEGF的表达均逐渐降低，但实验组在第10天后降低幅度大于对照组[14]。另有国内学者陈鹏飞等[15]使用60只大鼠建立放射性皮炎模型，三氧橄榄油外涂照射部位，每天2次，连续外涂30 d，结果显示，三氧橄榄油组治疗5 d、10 d、15 d和30 d后创面愈合率均高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，随着治疗时间增加，bFGF、EGF灰度值也随之降低，在治疗后的第10天和第15天，三氧橄榄油组创面组织的bFGF、EGF灰度值与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。由此可见，bFGF、VEGF和EGF不仅在放射性皮炎动物明显组织中表达，同时其表达水平呈时间依赖性。

综上所述，黄芪多糖可能通过介导bFGF、VEGF和EGF的表达来降低炎症反应，促进小鼠创面皮肤愈合，从而发挥对放射性皮炎小鼠的保护作用。但本研究也存在一定局限，由于实验动物数量较少、观察时间较短、时间点较少，检测指标单一，与其对应的抑制通路未进行验证，后期有待进一步深入研究。