钌红染色和单克隆抗体免疫标记植物叶片中的果胶

李晓宝，孙振炳，姚曜，汤正捷，李晓平

(西南林业大学云南省胶黏剂与胶合制品重点实验室，昆明 650224)

果胶是自然界最复杂的化学物质之一，常存在于植物的根、茎、叶和果实等组织中[1]，早在1825年就从胡萝卜(Daucuscarotavar.sativa)中被分离出来。果胶质是黏结不同细胞的物质，主要存在于细胞壁的初生壁和胞间层[2-3]，但对于存在多层细胞壁的细胞(如初生壁、次生壁和胞内层的木质细胞)，果胶在各个细胞壁层之间的功能尚不明确。果胶分为直链区和毛发区，D-半乳糖醛酸通过α-1,4-糖苷键连接成主链，毛发区支链上的糖基种类则高达16种，且会随着植物种类、果胶储存时间的变化而变化[4-5]。

果胶应用广泛，可被应用于制备饮料、化妆品、保健品、药品、血浆替代品、重金属吸附剂等[6-8]。目前主要利用水果或果皮来生产果胶，除此以外，果胶还普遍存在于植物的根茎叶中。因此，植物叶片也可以用来提取果胶，但迄今为止对叶片中果胶含量和分布的研究报道甚少，尤其是利用单克隆抗体标记法对叶片中果胶进行研究的报道较少[9-11]。为了更好地开发利用叶片中的果胶成分，对一些药用叶片提取剩余物进行进一步价值的提升有着非常积极的意义。例如，将工业大麻叶提取大麻二酚(CBD)后再进一步进行果胶提取，将桉树叶提取桉树精油后再进一步提取果胶等，不仅可以拓宽果胶的原料来源，还可以提高植物叶片的利用价值和利用率。

笔者根据GB/T 10742—2008《造纸原料果胶含量的测定》对叶片的果胶含量进行测定，并利用钌红染色和单克隆抗体免疫标记法对叶片中的果胶进行标定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大麻(CannabissativaL.)叶，采自云南农业科学研究院经济作物研究所；云南松(Pinusyunnanensis)松针和慈竹(Neosinocalamusaffinis)叶，采自云南省昆明市；杨树(PopulusL.)叶、刺槐(RobiniapseudoacaciaL.)叶和榆树(UlmuspumilaL.)叶，采自山东省临沂市。6种叶片均为春季4—5月采集。

甲醛、冰醋酸和无水乙醇，均为分析纯；伦敦白胶(LR White)树脂、钌红染色剂、TBS缓冲液(pH 7.4～7.6，0.05 mol/L三乙醇胺缓冲盐水溶液)、TBST缓冲液(pH 7.4～7.6，0.05 mol/L三乙醇胺缓冲盐水溶液+质量分数0.1% Tween-20)、山羊原血清、甘油PBS封片剂。上述试剂均购自昆明硕阳生物有限责任公司。

单克隆第一抗体材料共有4种，分别是：JIM5抗同型半乳糖醛酸聚糖(单克隆抗体抗同型半乳糖醛酸聚糖)、JIM7抗同型半乳糖醛酸聚糖(单克隆抗体抗同型半乳糖醛酸聚糖)、LM5抗-(1-4)-β-D-半乳聚糖[单克隆抗体(1-4)-β-D-半乳聚糖] 和LM6抗-(1-5)-α-L-阿拉伯聚糖[单克隆抗体(1-5)-α-L-阿拉伯聚糖]。单克隆第二抗体为山羊抗大鼠(IgG)，是与第一抗体结合的抗体，可改善应用结果并减少假阳性或阴性结果。

1.2 实验方法

1.2.1 果胶含量的测定

根据GB/T 2677.2—2011《造纸原料水分的测定》测定水分。

果胶的含量以测定的果胶酸钙的含量表示：

(1)

式中：X为果胶的含量(以果胶酸钙计)，%；m为滤纸的绝干质量，g；m1为烘干至质量恒定后沉淀连同滤纸的质量，g；m0为试样质量，g；w为试样含水率，%。

1.2.2 叶片切片制备

叶片切片的制备主要包括样品采集固定、脱水、钌红染色、包埋和切片5个步骤。

1)样品采集固定：分别采集新鲜杨树叶、云南松松针、槐树叶、榆树叶、慈竹叶和大麻叶；切成5 mm×5 mm×5 mm(长×宽×厚)的小块，浸泡于由体积分数50%甲醛-乙酸-乙醇(FAA)固定液(90 mL 体积分数50%乙醇+体积分数38%甲醛和冰醋酸各5 mL)中固定24 h。

2)脱水：将样品从FAA固定液中取出，用琼脂固定，将琼脂固定的叶片切成宽3 mm的细条状，然后用体积分数50%乙醇浸泡脱水，接着分别用70%，80%，90%和100%乙醇梯度浸泡，每个梯度脱水4 h以上，100%乙醇需进行2次脱水(60 min以上)。

3)钌红染色：钌红可以通过静电与羧基(酸性基团)结合，在电子显微镜下出现电子密度高度着色，在光学显微镜下则呈现出本色。叶片浸没于质量分数0.02%钌红染色剂中，对叶片进行染色[14]。

随着我国社会经济的不断发展，房地产行业发展迅猛，成为我国重要支柱产业之一。在其快速发展的同时，伴随出现了一系列的行业风险，其中房地产金融风险成为当前亟待解决的重要问题。近年来，房地产行业热度一直居高不下，其融资渠道单一，国家宏观调控不到位等问题逐渐暴露并加深，导致房地产金融风险剧增，加大了房地产行业危机，及时解决这些问题，制定行之有效的应对策略，是当前房地产行业工作的重点。因此，房地产行业融资渠道多元化，加强国家宏观调控等手段的实施对降低房地产金融风险具有重要意义。

4)包埋：采用伦敦白胶(LR White)包埋[15-16]。将钌红染色和未染色的样品移至新的离心管中，用移液枪移取体积比为1∶1的无水乙醇和纯的伦敦白胶树脂混合溶液(由 50 g树脂+0.99 g催化剂配制而成)直到树脂完全没过样品，在室温下浸泡渗入4 h以上；接着用干净的镊子将材料放入新的离心管中，然后用移液枪移取纯度为100%的伦敦白胶树脂加入离心管中直到树脂完全没过样品，静置2 h以上，重复数次；之后取出样品放入包埋用胶囊中，注入纯的伦敦白胶树脂，充满胶囊，将胶囊在不接触水的情况下用超声清洗机处理60 min；接着用循环水真空泵抽真空3次(3～5 h/次)，最后将胶囊放入电热鼓风干燥箱中65 ℃聚合24 h(60 ℃时聚合16 h以上)。

5)切片：在37 ℃水中将胶囊溶解，对聚合好的材料块进行修整，用切片机进行切片，厚度为5～10 μm，将切好的切片置于滴有水滴的干净载玻片上；接着将放有切片的载玻片放在70 ℃的烘干台上，烘烤至少5 min，直到水滴蒸干，切片完全干燥平铺于载玻片；切片完全干燥后，为保证叶片中果胶成分能够被充分染上颜色，钌红染色的样品可再一次进行染色，烘干待用[17-19]。

1.2.3 免疫标记

将切好的未被染色的切片连同载玻片置于TBS和TBST 的混合缓冲溶液中浸润10 min；取出玻片，将山羊原血清和TBST缓冲液混合配出1/30的山羊原血清溶液滴加在玻片上，将半薄切片封闭1 h；然后，分别在4个载玻片上滴加经TBST 缓冲溶液稀释为1/4的单克隆第一抗体 (JIM5、JIM7、LM5和LM6)，并在4 ℃的冰箱中与半薄切片反应12 h以上；接着用TBS洗涤3次(5 min/次)，洗涤后风干玻片；再用经TBST 缓冲溶液稀释为1/100的单克隆第二抗体[山羊抗大鼠(IgG)]对半薄切片进行封闭，在37 ℃烘箱中烘干1 h；用TBS缓冲溶液清洗样品，清洗5次(5 min/次)，之后用蒸馏水清洗2次(5 min/次)；置于干燥通风处晾干，用甘油PBS封片剂封片，用荧光显微镜进行拍照。

2 结果与分析

2.1 不同叶片中的果胶含量

经测定6种叶片在样品尺寸不同时的果胶含量(质量分数)不同，测定结果见表1。工业大麻叶片的果胶含量为12%～17%、杨树叶片为10%～15%、榆树叶片为10%～17%、刺槐叶片为5%～8%、松针为1.5%～2.5%、慈竹叶在1%以下，其中工业大麻叶片、杨树叶、榆树叶的果胶含量在6种叶片中相对较多，刺槐叶片次之，慈竹叶的果胶含量在6种叶片中最少。对于同一种叶片，当颗粒尺寸由20～40目减小到80目时，叶片的果胶含量都在逐渐地增加，而当颗粒尺寸小于80目时叶片的果胶含量开始逐渐地降低。这可能是由于果胶主要存在于胞间层和初生壁中，在植物细胞生长过程中起着调控作用，有一定的韧性，不易被粉碎，所有在80目以下颗粒中主要是生物质材料的其他化学成分，有待进一步研究。

表1 不同植物叶片中的果胶含量Table 1 Pectin contents in different plant leaves

2.2 不同叶片中的钌红染色图像

6种植物叶片经钌红染色后的果胶分布见图1。植物叶片中的果胶成分能够被钌红染色剂染上红色，颜色深浅与果胶含量的多少成正比，对比6种叶片的着色情况，大麻叶、刺槐叶、杨树叶、榆树叶的果胶含量比其他两种多，松针次之，慈竹叶在6种叶片中最少。比较各组织的钌红着色深度，大麻叶、刺槐叶、榆树叶和杨树叶叶肉细胞的果胶含量比表皮细胞多；松针表皮细胞和静脉组织的果胶含量比叶肉细胞少，果胶多分布于叶肉细胞中；慈竹叶表皮细胞、叶肉细胞的果胶含量较少，静脉组织的果胶含量多一些。

1. 表皮细胞; 2. 叶肉细胞; 3. 静脉组织。a1～a2)不同放大倍数下的大麻叶; b1～b2)不同放大倍数下的松针; c1～c2)不同放大倍数下的刺槐叶; d1～d2)不同放大倍数下的杨树叶; e1～e2)不同放大倍数下的榆树叶; f1～f2)不同放大倍数下的慈竹叶。图1 钌红染色的6种叶片Fig. 1 Six kinds of leaves stained with ruthenium red

2.3 不同叶片中果胶的荧光图像

2.3.1 不同波长荧光照射下的木质素粉与果胶粉

免疫标记是以抗原和抗体的特异性结合产生抗原-抗体免疫复合物，通常是指使用荧光素、放射性同位素、酶、胶体和化学(或生物)发光剂作为标记，并且使用标记的抗体或抗原以及相应的抗原或抗体用于特异性抗原-抗体反应[20]。

L1～L3 和P1～P3分别为木质素粉和经过JIM5标记后的果胶粉在3种不同波长荧光[紫外(UV)荧光波长为372～456 nm，绿色荧光波长490～520 nm，黄色荧光波长530～615 nm]照射下的情况，如图2所示。由图2可知，3种波长下均有亮光，即木质素粉和经过JIM5标记后的果胶粉在荧光照射下都有自发荧光；但比较L1和P1可以看到在UV荧光照射下，木质素粉的亮光暗淡且不明显，经过JIM5标记后的果胶粉明显比木质素粉发出的荧光要亮且均匀，因此选择UV荧光作为光源照射，分析果胶在叶片中的分布状态。

图2 不同波长荧光照射下的木质素粉与果胶粉Fig. 2 Lignin powder and pectin powder under different wavelength fluorescence irradiations

2.3.2 单克隆抗体标记叶片中的果胶成分

在UV荧光照射下经LM5、LM6、JIM5、JIM7这4种单克隆抗体标记的6种植物叶片果胶成分均发出亮光，发出亮光的强弱和果胶含量的多少成正相关的关系，结果见图3～8。对比6种叶片发出亮光的强弱可以知道大麻叶、杨树叶、榆树叶、刺槐叶的果胶含量比其他2种叶片多，云南松松针次之，慈竹叶在6种叶片中果胶含量最少。这与前面果胶含量测定及钌红染色的结果是一致的。

比较叶片中不同部位荧光的亮度，4种单克隆抗体标记的大麻叶片、刺槐叶、榆树叶和杨树叶叶肉细胞的荧光亮度比表皮细胞部分亮，即叶肉细胞的果胶含量比表皮细胞多。以此类推，松针的表皮细胞和静脉组织的果胶含量比叶肉细胞少，主要集中在叶肉细胞中；慈竹叶表皮细胞、叶肉细胞的果胶含量较少，静脉组织较多。另外，经过4种单克隆抗体标记之后，6种叶片中的荧光分布没有显著区别，说明在这6种叶片中4种单克隆抗体能够标记的特定糖分均有分布，即果胶中的糖分是呈混合分布的状态没有特定的富集区域。

1. 表皮细胞; 2. 叶肉细胞。图3 4种单克隆抗体标记的大麻叶中的果胶成分Fig. 3 Pectin components in Cannabis sativa L. leaves labeled with 4 monoclonal antibodies

1. 表皮细胞; 2. 叶肉细胞; 3. 静脉组织。图4 4种单克隆抗体标记的云南松松针中的果胶成分Fig. 4 Pectin components in Pinus yunnanensis needles labeled with 4 monoclonal antibodies

1. 表皮细胞; 2. 叶肉细胞; 3. 静脉组织。图5 4种单克隆抗体标记的刺槐叶中的果胶成分Fig. 5 Pectin components in Robinia pseudoacacia L. leaves labeled with 4 monoclonal antibodies

1. 表皮细胞; 2. 叶肉细胞。图6 4种单克隆抗体标记的杨树叶中的果胶成分Fig. 6 Pectin components in Populus L. leaves labeled with 4 monoclonal antibodies

1. 表皮细胞; 2. 叶肉细胞。图7 4种单克隆抗体标记的榆树叶中的果胶成分Fig. 7 Pectin components in Ulmus pumila L. leaves labeled with 4 monoclonal antibodies

1. 表皮细胞; 2. 叶肉细胞; 3. 静脉组织。图8 4种单克隆抗体标记的慈竹叶中的果胶成分Fig. 8 Pectin components in Neosinocalamus affinis leaves labeled with 4 monoclonal antibodies

3 结 论

通过测定果胶含量(质量分数)、钌红染色和单克隆抗体标记技术来表征叶片中的果胶成分，确定了植物叶片中有大量果胶的存在，为发掘新的果胶提取来源提供了依据。具体结论如下：

1)大麻叶、杨树叶和榆树叶中的果胶含量(质量分数)分别是12%～17%，10%～15%和10%～17%，含量均在10%以上，在6种叶片中较高，刺槐叶和松针次之，慈竹叶最少。

2)钌红染色和单克隆抗体标记技术均可有效表征果胶，果胶含量与叶片钌红染色剂的着色深度、果胶单克隆抗体标记的荧光亮度均呈正相关关系。在6种叶片中，大麻叶、杨树叶和榆树叶被钌红着色的深度较深，免疫标记荧光亮度较亮，尤其是叶片的叶肉细胞，因此这3种树叶具有提取果胶质的潜在价值。经过4种单克隆抗体标记之后，6种叶片中的荧光分布没有显著区别，即4种单克隆抗体能够标记的特定糖分在6种叶片中均有分布，果胶中的糖分呈混合分布状态，没有特定的富集区域。