荒漠草原不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌群落多样性特征研究

王子寅，刘秉儒，牟红霞，李子豪

(1.北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏 银川 750021；2.国家民委黄河流域农牧交错区生态保护重点实验室，宁夏 银川 750021；3. 宁夏特殊生境微生物资源开发与利用重点实验室，宁夏 银川，750021; 4.宁夏大学生态环境学院/西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室，宁夏 银川 750021)

柠条锦鸡儿(CaraganakorshinskiiKom.)是豆科(Leguminosae)锦鸡儿属(Caragana)的落叶大灌木植物，广泛分布于亚洲中部、我国的西北干旱、半干旱及半湿润荒漠草原区[1]。柠条根系极其发达，具有极强的抗逆性，同时具有防风固沙、保持水土、改良土壤等作用[2]，且防风固沙生态效益显著[3]，因此，在我国西北地区大面积种植柠条用于固定沙地和促进土壤质地的改良。土壤风蚀是困扰我国西北荒漠草原地区土地荒漠化的重要环境问题之一[4]。风蚀不仅造成土地植被的破坏、退化，导致土地生产力的下降，还会给当地带来严重的生态和环境问题[5]。灌丛堆是干旱、半干旱荒漠草原地带的风沙侵蚀过程中遭遇植物灌丛的阻拦后，在其周围堆积形成的一种主要的植被类型[6]。灌丛堆能够有效阻止土壤风蚀和养分流失[7]、提高物种多样性及土壤微生物的分布格局[8]，并且对土壤形成过程、微生物群落的结构和功能有着重要影响[9]。

土壤微生物是荒漠草原地区生态系统的重要组成部分，对凋落物的分解和维持生态系统的稳定有着重要作用，参与了土壤中几乎一切生化反应[10]。此外，土壤微生物主导着土壤的形成和演化[11]，并且荒漠草原微生物作为土壤养分状况的主要指标，能够直观反映荒漠草原生态功能的演变[12]。真菌作为土壤微生物中重要组成部分之一，具有最为丰富的生物数量和最活跃的生理活动[13-14]，其对土地的利用及植被变化比细菌更加敏感，对植物的生产力和养分循环的影响极其深远[15]。土壤真菌的多样性及活性能够有效提高土壤生态系统的稳定性，增加缓冲荒漠草原退化的能力[16]。因此，明确土壤真菌群落的结构及土壤理化性质的变化，对于了解柠条灌丛堆发育阶段养分情况和可持续性发展具有重要意义。

目前，对于柠条的研究主要集中于柠条林土壤水分[17-19]、化学成分[20]、种质资源培育[21]以及土壤微生物[22-23]等方面。但对于不同发育阶段的柠条灌丛堆、土壤真菌群落结构及多样性的研究少有报道。由于土壤真菌群落结构复杂多变、数量巨大以及传统技术的限制，对真菌群落的研究不够深入[24]，近年来快速发展的高通量测序技术，与第一代测序技术相比具有耗时少、重复性低、测序覆盖度更高、价格便宜等诸多优点[25]，为检测微生物多样性、群落结构和环境变化提供了强有力的手段[26]，能全面有效地认识土壤真菌群落。在本研究中，对于不同发育阶段的柠条灌丛堆，通过高通量基因测序技术对其土壤真菌的群落组成和多样性的变化进行研究，明确土壤真菌群落对于发育时期中土壤养分变化的影响，旨在为柠条人工林的可持续发展及风沙治理防治提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于宁夏盐池县南部荒漠草原(37°23′N，106°58′E)，地处黄土高原与鄂尔多斯台地的交界处，地势南高北低，是典型的大陆性季风气候。年平均降水量约300 mm，主要集中于7—9月，占全年降雨量的60%以上。年平均气温约为8.2℃，有效积温约为3 000℃，无霜期120～150 d，。当地土壤类型主要由灰钙土、风沙土组成，常见植物种类以干旱、半干旱类型为主，如柠条锦鸡儿(CaraganakorshinskiiKom.)、赖草 (Leymussecalinus(Georgi) Tzvel)、白草(PennisetumcentrasiaticumTzvel)、糙隐子草(Cleistogenessquarrosa(Trin.) Keng)、长芒草 (StipabungeanaTrin )、达乌里胡枝子(Lespedezadaurica(Laxm.) Schindl.)、米蒿(Artemisiadalai-lamaeKrasch)等。

1.2 研究方法

1.2.1 样地设置及样品采集 于2020年8月下旬植物生长旺盛时期，随机选取15个外形规则、生长态势均匀一致但大小有梯度差异的柠条灌丛堆(所选取最大、最小灌丛堆基本可以代表当地最大、最小灌丛堆)。参考熊小刚等[27]的方法将选取的15个灌丛堆按照高度及水平差异将其划分为生长期(Growing)、成熟期(Mature)、衰退期(Recession)3类灌丛堆，每组分别选取5个灌丛。采样时分别在灌丛堆顶部(U)、中部(M)及底部(D)三个部位采集土样，将东、南、西、北4个方向的0～10 cm土层同一部位土样等量混匀后作为一个样品，然后将每个样品分成两份，一份立即放入冰盒带回实验室用于微生物特征测定，另一份室内风干后测定土壤理化性质。

1.2.2 土壤理化性质及养分含量的测定 经自然风干后的土壤样品，测定土壤电导率(EC)、pH、有机碳(SOC)、总磷(TP)、速效磷(AP)、总氮(TN)等指标。土壤pH值采用2.5∶1的水土比的电位计法，EC用便携式电导率仪测定，SOC采用TOC测定仪测定。TP采用硫酸-高氯酸消煮-钼锑抗比色法测定； AP采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定。TN采用硫酸钾-硫酸铜-硒粉消煮，定氮仪自动分析法测定[28]。

1.2.3 样本DNA提取、文库构建及高通量测序 样品送至美吉生物医药科技(上海)有限公司进行DNA提取、文库构建及高通量测序。ITS序列引物为通用引物：ITS1-1F-F(5’- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)；ITS1-1F-R(5’- GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)。

1.2.4 统计分析 使用美吉生物云平台(www.majorbio.com)[29]进行Alpha多样性(包括Sobs、Shannon、Simpson、Chao1等指数)、真菌群落结构等数据分析并绘制相关图。

使用IBM SPSS Statistics 24.0软件对Alpha多样性、土壤理化性质等数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌群落OUT组成及结构

通过Illumina MiSeq测序平台所得的稀释曲线可以判断本次测序数据量是否足够，以及可以直接反映样品品种的物种丰度[30]。由图1可知，抽取的序列条数达到40000条以上，且曲线已经趋于平缓，表明本次研究土壤样本测序数量达到标准且数据合理[31]。本研究从不同发育时期柠条灌丛堆土壤中共获得1982950条有效序列，平均每个土壤样品有效序列为39659条。

图1 不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌群落的稀释曲线

Veen图可以较为直观地表现不同发育时期柠条灌丛堆土壤真菌群落OUT的组成差异及其共有物种的情况。由图2可知，在OUT水平上，发育阶段土壤真菌群落OUT占总OUT序列数的15.40% (410)，成熟期土壤真菌群落OUT占总OUT序列数的14.27% (380)，衰退期土壤真菌群落OUT占总OUT序列数的12.96% (345)。另外，生长期和成熟期共有的OTU数量为244 (9.17% )，成熟期和衰退期共有的OTU数量为185 (6.95% )，衰退期和生长期共有的OTU数量为190 (7.14% )，生长期、成熟期和衰退期三者共有的OUT数量为908 (34.11%)。

图2 不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌群落韦恩图

2.2 不同发育阶段柠条灌丛堆土壤理化性质分析

从不同发育阶段柠条灌丛堆土壤理化性质的测定表明(见表1)，采样土壤pH在7.0～8.0之间，均呈弱碱性。对于不同发育阶段，成熟期顶部的SOC、AP及底部的EC均为最大值，为4.254 g·kg-1、3.900 mg·kg-1、83.2 ms·cm-1，显著高于其他对照组;各阶段TP、TN无显著差异，除生长期的中部TN显著高于其他对照组,沙堆顶、中、底部的AP均随发育阶段的变化先升高后降低；灌丛堆顶部的SOC、TP、TN随发育阶段的变化先升高后降低；灌丛堆中部的SOC、TP、TN随发育阶段的变化呈持续降低趋势；灌丛堆底部的SOC随发育阶段的变化一直降低，而TP、TN随发育阶段的变化先增加后降低。对于同一发育阶段，除生长期顶部、成熟期底部的SOC大于其上中部和顶部的EC高于中部和底部之外，各指标无显著差异。

表1 不同发育阶段柠条灌丛堆土壤理化性质

2.3 不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌群落多样性

通过Sobs 指数(Sobs index)、Shannon 指数(Shannon index)、Simpson 指数(Simpson index)、Ace 指数(Ace index)、Chao 1指数(Chao1 index) 对不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌丰富度和群落多样性进行分析。由表2可知，本研究测序覆盖率在99.74%～99.87%之间，表明了测序深度能够真实反映不同发育阶段柠条灌丛堆真实的土壤真菌群落组成及其多样性的相关信息。在不同发育阶段，Sobs 指数以及Chao 1指数无显著差异，Ace 指数存在显著差异，但土壤真菌丰富度和群落多样性变化大致相同，表现为先增后减的规律，即在本次研究中，发育阶段对土壤真菌群落的丰度影响显著；而在相同发育阶段，成熟期不同部位的土壤真菌丰富度也存在一定差异，其余发育阶段不同位置的土壤真菌丰富度无显著差异。Shannon 指数和Simpson 指数通常用于表示Alpha多样性指数，Shannon 指数数值越大，土壤真菌群落的多样性就越高，Simpson 指数则与其相反[32]。本研究中，在不同发育阶段，Shannon 指数和Simpson 指数无显著性差异，其中不同发育阶段不同部位土壤真菌群落的Shannon 指数均呈先增加后减少状态，且生长期和成熟期阶段的Shannon 指数大于衰退期阶段；除各发育阶段顶部的Simpson 指数大小相差无几，生长期和成熟期阶段的Simpson 指数远小于衰退期阶段的Simpson 指数。

表2 不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌丰富度和群落多样性指数

2.4 不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌群落结构分析

通过对OUT代表序列进行物种分类学注释并整理类别，共识别13门、40纲、100目、235科、524属和822种。

由图3可知，不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌群落丰富度较高的门有子囊菌门(Ascomycota，占79.34%～86.00%)、担子菌门(Basidiomycota，占8.19%～8.78%)以及被孢菌门(Mortierellomycota，占3.56%～8.14%)。其中子囊菌门丰度随发育阶段先升高后降低，在成熟期阶段最大；担子菌门和被孢菌门丰度随发育阶段先降低后升高，且均在生长期阶段最大，分别为8.748%、8.14%。

图3 土壤真菌在门水平上的相对丰度

由图4可知，丰度前10的纲有：粪壳菌纲(Sordariomycetes，占27.10%～36.23%)、座囊菌纲(Dothideomycetes，占25.69%～35.30%)、散囊菌纲(Eurotiomycetes，占12.64%～16.33%)、伞菌纲(Agaricomycetes，占7.07%～7.57%)、unclassified_p_ Ascomycota、被孢霉纲(Mortierellomycetes，占3.29%～7.62%)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、unclassified_k_ fungi、盘菌纲(Pezizomycetes)、银耳纲(Tremellomycetes)。其中粪壳菌纲丰度随发育阶段的变化而增加；座囊菌纲丰度随发育阶段的变化先升高后降低；被孢霉纲丰度随发育阶段的变化而降低。

图4 土壤真菌在纲水平上的相对丰度

2.5 不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌优势类群与土壤理化性质的关系

由表3可知，在种水平上，SOC、TP、AP、TN、EC、pH均与土壤真菌优势类群存在相关关系。其中，AP和SOC对土壤真菌群落的影响最大；AP对物种unclassified_f__Nectriaceae、Penicillium、unclassified_o__Xylariales、unclassified_k__fungi、unclassified_o__Sordariales有显著负相关关系，对物种Beauveria、unclassified_f__Phaeosphaeriaceae、Neosetophoma、Phaeomycocentrospo-ra、Didymella有显著正相关关系；SOC对Beauveria、unclassified_f__Phaeosphaeriaceae、Neosetophoma、Clad-osporium、Metarhizium、Cordyceps有显著正相关关系，仅对unclassified_f__Ceratobasidiaceae有显著负相关关系；TN、pH仅分别对物种unclassified_c__Dothideomycetes和un-classified_k__fungi有显著负相关关系；EC仅对Didymella和Myrothecium有显著相关关系；TP对unclassified_f__Phaeosphaeriaceae、Neosetophoma、Penicillium和Leohumicola有显著相关关系。

表3 不同发育阶段柠条灌丛堆土壤真菌优势菌群与土壤理化因子的相关性

2.6 土壤真菌网络分析与功能预测

物种相关性网络图主要反映某一环境条件下各分类水平的物种相关性。如图5所示，图中节点的大小表示物种丰度大小，不同颜色表示不同的物种；连线的颜色表示正负相关性，红色表示正相关，绿色表示负相关；线的粗细表示相关性系数的大小，线越粗，表示物种之间的相关性越高；线越多，表示该物种与其他物种之间的联系越密切。该网络图不连通，分为三个部分，共48个边，对应32个节点。在丰度前50的OUT中，正相关OUT占比64.57%，负相关OTU占比为35.43%，表明了本研究样地中土壤真菌共生关系大于竞争关系。50个物种OUT主要属于子囊菌门和被孢霉门。

图5 土壤真菌网络图分析

使用FUNGuild微生态工具进行土壤真菌功能注释[33]，如图6所示。检测出的土壤真菌大致分为共生营养型(Symbiotroph)、病理营养型(Pathotroph)和腐生营养型(Saprotroph)三类功能型，分属18种，腐生营养型(Saprotroph)包括未定义腐生真菌(Undefined saprotroph，占14.89%～20.91%)、内生真菌-凋落物腐生真菌-土壤腐生真菌-未定义腐生真菌(Endophyte-Litter saprotroph-Soil saprotroph-Undefined saprotroph，占3.29%～7.62%)、动物病原体-植物病原体-土壤腐生真菌-未定义腐生真菌(Animal pathogen-Plant pathogen-Soil paprotroph-Undefined saprotroph，占3.02%～6.57%)、外生菌根-真菌寄生虫-土壤腐生菌-未定义腐生真菌(Ectomycorrhizal-Fungal parasite-Soil saprotroph-Undefined saprotroph，占0.69%～4.87%)、真菌寄生虫-植物病原体-植物腐生真菌 (Fungal parasite- Plant pathogen- Plant saprotroph，占1.88%～4.97%)、动物病原体-植物病原体-未定义腐生真菌(Animal pathogen- Plant pathogen- Undefined saprotroph，占1.65%～4.85%)等14种；病理营养型(Pathotroph)包括植物病原体(Plant pathogen，占3.77%～4.57%)和动物病原体(Animal pathogen，占3.06%～5.77%)；共生营养型(Symbiotroph)包括动物病原体-棒状内生真菌-真菌寄生虫 (Animal pathogen-Clavipitaceous endophyte-Fungal parasite)和丛枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal)。其中，衰退期的未定义腐生真菌(Undefined saprotroph，占20.92%)显著高于生长期(15.99%)和成熟期(14.89%)；生长期的内生真菌-凋落物腐生真菌-土壤腐生真菌-未定义的腐生真菌(Endophyte-Litter saprotroph-Soil saprotroph-Undefined saprotroph，占7.62%)高于成熟期(3.29%)和衰退期(3.89%)。

图6 FunGuild功能预测相对丰度柱形图

3 讨 论

左小安等[34]发现灌丛堆对土壤养分有明显的富集作用。本研究中，除TP和pH无显著性差异，其余土壤因子在柠条灌丛堆的不同发育阶段均有显著性差异。陈鸿洋等[35]研究表明在灌丛堆的发育过程中能够有效提高沙堆土壤的养分含量，因此我们推测本研究选取的柠条灌丛堆年份较为足够，对土壤养分有一定的富集作用。在相同发育阶段的不同部位，土壤养分也存在着一定的差异：SOC、TP、AP等土壤理化性质基本在沙堆顶部呈现最大值，这可能是由于沙堆顶部形成时间较其他部位长，土壤真菌数量较为活跃。

通过对柠条灌丛堆土壤真菌群落的Alpha多样性分析发现，成熟期阶段的土壤真菌多样性和丰富度高于生长期和衰退期，此时成熟期土壤真菌的数量最多且最活跃，说明柠条灌丛堆的发育为土壤真菌提供了生存空间，改善了植被生存的条件，这与梁香寒[36]、王彦武[37]等人的研究结果一致。此外，各发育阶段内部土壤真菌多样性和丰富度差异性不显著。

本研究中，柠条灌丛堆土壤中丰富度最大的真菌菌门是子囊菌门(占79.34%～86.00%)，与图5中结果相同，这与众多干旱区研究结果[38-40]一致，说明子囊菌门适合在盐碱地生存且分布极其广泛。高微微等[41]发现在城市黄檗林和白桦林土壤中子囊菌门真菌最为丰富，陆梅等[42]发现沼泽化草甸土中子囊菌门真菌同样较为丰富，这表明了土壤真菌具有极为丰富的多样性，并且在不同的土壤类型中均可大量存在。纲水平上相对丰度较高的是粪壳菌纲(Sordariomycetes，占27.10%～36.23%)、座囊菌纲(Dothideomycetes，占25.69%～35.30%)、散囊菌纲 (Eurotiomycetes，占12.64%～16.33%)，同属于子囊菌门，这3种真菌类群大多为腐生菌，作为土壤主要的分解者，能够降解难降解有机质，在生态系统的物质循环中具有重要作用[43]。粪壳菌纲大多来自于动物粪便，说明柠条灌丛堆能有效聚集土壤微生物，为土壤微生物提供了一定的生存空间。

担子菌门真菌丰度呈先降低后上升的趋势，可能由于柠条作为灌木，在生长期和衰退期产生的枯落物比成熟期多，而降解木质素的真菌大都属于担子菌门[44]，为担子菌门真菌提供了更多的生长空间和大量养分。

土壤真菌群落结构和土壤理化因子的相关性分析发现，AP和SOC是影响土壤真菌群落结构的主要影响因子。碳和磷是植物不可或缺的营养物质，能促进植物的生长发育[45]。但也有研究表明，pH是土壤真菌群落的影响因子[46]，TP是土壤真菌的重要影响因素[47]，这就表明不同地区影响土壤真菌的土壤养分不同，而在本研究中，可能由于样地pH差异不大，所以对土壤真菌群落结构影响不显著。

基于土壤真菌基因功能预测，发现柠条灌丛堆土壤真菌群落腐生营养型占据着主导地位，而病理营养型占比较小，这说明了柠条灌丛堆真菌群落的结构较为健康。

4 结 论

本研究以宁夏盐池地区不同发育阶段的柠条灌丛堆为研究对象，基于高通量测序对其土壤真菌群落结构进行研究，综合土壤理化性质，得出以下结论：

(1)各发育阶段柠条灌丛堆不同部位对土壤养分、土壤真菌数量有一定富集作用，但pH、TN的变化不显著。获得的2662个OUT属于13门、40纲、100目、235科、524属和822种：门水平上，子囊菌门(Ascomycota，占79.34%～86.00%)、担子菌门(Basidiomycota，占8.19%～8.78%)以及被孢菌门(Mortierellomycota，占3.56%～8.14%)是主要优势菌门；粪壳菌纲(Sordariomycetes，占27.10%～36.23%)、座囊菌纲(Dothideomycetes，占25.69%～35.30%)、散囊菌纲(Eurotiomycetes，占12.64%～16.33%)、伞菌纲(Agaricomycetes，占7.07%～7.57%)是主要的优势菌纲。

(2)TP和SOC是影响土壤真菌群落的主要影响因子，其中AP对物种unclassified_f__Nectriaceae、Penicillium、unclassified_o__Xylariales、unclassified_k__fungi、unclassified_o__Sordariales有显著负相关关系，对物种Beauveria、unclassified_f__Phaeosphaeriaceae、Neosetophoma、Phaeomycocentrospora、Didymella有显著正相关关系：SOC对Beauveria、unclassified_f__Phaeosphaeriaceae、Neosetophoma、Cladosporium、Metarhizium、Cordyceps有显著正相关关系，仅对unclassified_f__Ceratobasidiaceae有显著负相关关系。

柠条灌丛堆功能真菌群有3类营养型(腐生、共生、病理营养型)和18类交叉的营养型，其中土壤真菌主要以腐生营养型为主。