复方黄柏液对内皮细胞增殖迁移成管影响的机制研究

陈润铭　杜玉青　李友山　刘亚莉　刘凤桐　谢存香　安琪　董学宇

摘要 目的：探索复方黄柏液对内皮细胞增殖迁移成管影响的机制，为复方黄柏溶液用于治疗糖尿病足溃疡提供依据。方法：用CCK-8法检测药物毒性，探索复方黄柏液使用的最佳药物浓度、CCK-8法检测细胞增殖活力、细胞划痕实验检测细胞迁移率、成管实验检测细胞成管能力、蛋白质印迹法（Western Blotting）实验检测蛋白表达水平的变化。结果：使用复方黄柏液后，高糖组内皮细胞的增殖、迁移、成管能力较前有了提高，并降低了促血管生成素2（Ang-2）蛋白水平，增加血管内皮生长因子（VEGF）和磷酸化酪氨酸激酶受体-2（P-Tie）蛋白水平。结论：复方黄柏液通过促进内皮细胞增殖、迁移、成管以及影响蛋白表达水平，改善内皮功能障碍来实现对糖尿病足溃疡的恢复。

关键词 复方黄柏液;中药复方制剂;内皮细胞;增殖;迁移;成管;机制;糖尿病足溃疡

Effect and Mechanism of Fufang Huangbai Liquid on Proliferation，Migration，and Tube Formation of Endothelial Cells

CHEN Runming，DU Yuqing，LI Youshan，LIU Yali，LIU Fengtong，XIE Chunxiang，AN Qi¹，DONG Xueyu

（1 Department of Peripheral Blood Vessels，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China;

2 Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China;

3 Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050013，China）

Abstract Objective：To explore the effect and mechanism of Fufang Huangbai Liquid on endothelial cell proliferation，migration，and tube formation and provide evidence for the treatment of diabetic foot ulcer by Fufang Huangbai Liquid.Methods：Cell Counting Kit-8（CCK-8） was used for the detection of drug toxicity to determine the optimal concentration of Fufang Huangbai Liquid.Cell proliferation activity was detected by CCK-8 assay，cell migration rate by wound healing assay，tube formation ability by tube formation assay，and protein expression changes by Western blot.Results：After Fufang Huangbai Liquid treatment，the proliferation，migration，and tube formation abilities of endothelial cells in the high-glucose group were potentiated.Furthermore，the angiopoietin 2（Ang2） protein expression was reduced，and the protein expression levels of vascular endothelial growth factor（VEGF） and phosphorylated tyrosine kinase receptor-2（p-Tie2） were up-regulated.Conclusion：Fufang Huangbai Liquid can relieve diabetic foot ulcer by promoting endothelial cell proliferation，migration，and tube formation，affecting protein expression，and improving endothelial dysfunction.

Keywords Fufang Huangbai Liquid; Chinese medicinal compound preparations; Endothelial cell; Proliferation; Migration; Tube formation; Mechanism; Diabetic foot ulcer

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.006

糖尿病足是糖尿病最严重和危险的并发症之一，它具有高致残率、难愈合的特点。在最新版的糖尿病足防治指南指出，我国糖尿病足溃疡的年发病率为8.1%，Wagner 3级以上的患者占到了45%，总截肢率19.03%，年死亡率为14.4%[1]。糖尿病足一旦发生，由于患者长期处于高血糖状态，血管新生缓慢，愈合异常艰难。因而控制糖尿病足进一步恶化以及促進糖尿病足溃疡的愈合是糖尿病足研究的重点和难题。

近年来，有研究发现内皮细胞具有促进血管新生的作用，而糖尿病足溃疡则一直因为血管再生困难成为治疗难题[2]。因而越来越多学者开始研究糖尿病足溃疡与内皮细胞的关系。张莹[3]认为血管内皮功能紊乱是糖尿病足的始动环节，改善内皮功能已经成为糖尿病足治疗的目标之一。李桃等[4]认为血管内皮细胞是糖尿病足溃疡愈合的重要参与者。除此之外，中医药与内皮细胞的关系也受到了关注。有研究表明，中药能够通过提高内皮细胞生长因子水平等多途径来保护内皮细胞[5]。

中医外治在糖尿病足溃疡治疗中发挥着特色的中医药作用。塌渍法属于外治法的一种，它最早见于《刘涓子鬼遗方》的“猪蹄汤洗疮”，利用中药熬制而成的溶液对伤口进行湿敷或者浸泡。复方黄柏液作为塌渍法的常用药物之一，被广泛应用于改善糖尿病足溃疡、肛周脓肿、湿疹等疾病。其中复方黄柏液对促进糖尿病足溃疡恢复效果尤为突出[6]。但复方黄柏液有关糖尿病足溃疡的作用机制临床鲜少报道。本研究探索复方黄柏液对内皮细胞增殖迁移成管影响的机制，为复方黄柏溶液用于糖尿病足溃疡治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 内皮细胞购自无锡菩禾生物医药技术有限公司，批号：CL-463。内皮细胞在37 ℃，5% CO条件下加入10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）在平衡盐溶液（Earle′s Balanced Salt Solution，EBSS）培养基中培养。

1.1.2 药物 复方黄柏液（山东汉方制药，生产批号：19042011）;葡萄糖（上海国药，生产批号：63005518）;氯沙坦（上海陶术生物科技有限公司，生产批号：T0215L）

1.1.3 试剂与仪器 FBS（北京沃凯生物技术有限公司，批号：SH30084.03）;0.25%胰酶（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0205）;细胞计数试剂（Cell Counting Kit-8，CCK8）（上海碧云天生物技术有限公司，批号：C0037）;Matrigel基底胶（BD Incorporated公司，美国，批号：354248）;Calcein AM（钙黄绿素乙酰甲酯）、丽春红S（北京索莱宝科技有限公司，批号：P8330、型号：C7600）;BCA蛋白定量试剂盒（广州赛国科技公司，批号：BL521A）;聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）膜（millipore公司，美国，批号：HATF00010）。细胞培养箱（Thermo Scientific公司，美国，型号：8000）;低速离心机（上海卢湘仪，型号：TDZ4B-WS）;倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本，型号：IX71）;酶标检测仪（Thermo公司，型号：MK3）;光学显微镜（上海精密公司生产，型号：XDS-1A）;电泳仪（BIO-RAD公司，美国，型号：mini protean 3 cell）;电转仪（大连竞迈科技有限公司生产，型号：PS-9）;一体式化学发光成像仪（上海勤翔科学仪器公司生产，型号：5300 Pro）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 1）CCK-8法检测药物毒性。实验设置8个组，观察组按照1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640（对应的浓度分别为20 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，2.5 mg/mL，1.25 mg/mL，0.63 mg/mL，0.31 mg/mL）给药复方黄柏液，空白组只有培养基，不加入复方黄柏液。2）CCK-8法检测内皮细胞增殖实验、细胞划痕实验、成管实验;蛋白质印迹法（Western Blotting）实验将设置A空白组、B高糖处理组（33 mmol/L）、C高糖处理组+复方黄柏涂液（1∶100、1∶200、1∶400）、D高糖处理组+氯沙坦（20 μmol/L）、E高糖处理组+复方黄柏涂液（1∶100）+氯沙坦（20 μmol/L）。

1.2.2 给药方法 1）取处于对数生长周期的内皮细胞培养24 h后，在相应的孔中，加入浓度为20 mg/mL，10 mg/mL，5 mg/mL，2.5 mg/mL，1.25 mg/mL，0.63 mg/mL，0.31 mg/mL的复方黄柏液。2）A组仅保留培养基;B组给予33 mmol/L高糖处理;C组表示内皮细胞给予33 mmol/L高糖后分别与浓度2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL的复方黄柏涂液（即原液1∶100、原液1∶200、原液1∶400）处理;D组表示内皮细胞给予33 mmol/L高糖处理与20 μmol/L氯沙坦处理;E组表示内皮细胞给予33 mmol/L高糖、2 mg/mL复方黄柏涂液和20 μmol/L氯沙坦处理。

1.2.3 检测指标与方法 1）CCK-8法检测药物毒性实验。将内皮细胞复苏，复苏24 h后观察细胞状态。当细胞密度到达80%以上时，表示能传代。用FBS漂洗2遍，加入0.25%的胰酶消化细胞，待细胞变圆后吸去胰酶，加入完全培养基终止消化。将细胞吹打为单细胞悬液，将细胞混匀;按一定的比例将细胞进行分盘，加适量培养液进行培养，放入37 ℃、5%浓度的CO培养箱中;待细胞长至对数生长期，调整细胞浓度为5×10 个/mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL，在37 ℃、5% CO培养箱内培养24 h;24 h后，给每孔加入20 μL的CCK-8，在37 ℃、5% CO培养箱内避光孵育2 h;酶标仪450 nm波长测量光密度（Optical Density，OD），根据OD值进行细胞活性分析。抑制率=1-观察组OD/对照组OD。2）CCK-8检测内皮细胞增殖实验。将处于对数生长期的细胞调整细胞浓度为5×10 个/mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL，37 ℃，5% CO培养24 h，按照上述组别给药24 h后，每孔加入20 μL的CCK8，在37 ℃、5% CO培养箱内避光孵育2 h测出OD值，分析细胞的增殖情况。3）细胞划痕实验。直尺、记号笔等实验仪器操作前紫外照射30 min，用记号笔在3.5 cm皿背后大约每隔0.5～1 cm用直尺均匀地划横线，每孔至少穿过5条线。在3.5 cm蒸发皿加入约含3×10个细胞悬液，保证过夜细胞密度为90%左右。第2天用200 μL枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕。用FBS洗细胞3次，去除划下的细胞。处理24 h后，显微镜下拍照，测量划痕宽度，观察细胞迁移情况。4）成管实验，实验前1 d，将Matrigel基质胶放入4 ℃冰盒过夜溶解，枪头盒、EP管、96孔板均4 ℃过夜预冷;次日在冰盒上进行铺胶，将Matrigel基质胶50 μL/孔加入96孔板，37 ℃培养箱中放置30 min;在胶凝固的过程中，按照分组，准备细胞悬液，细胞消化后将细胞悬液浓度调整到1×10 个/mL。每孔接种10 000细胞，然后放入培养箱中培养24 h。24 h后加入钙黄绿素染色，钙黄绿素氨酰酯（Calcein Acetoxymethyl Ester，Calcein AM）终浓度为0.25 μg/mL。钙黄绿素染色30 min后于荧光显微镜下观察拍照。5）Western Blotting实验。按照分组给药24 h后，用放射免疫沉淀法（Radio-Immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解细胞，并加入适量的蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl Fluoride，PMSF），置于冰上裂解、离心后弃上清提取细胞总蛋白。通过BCA蛋白定量试剂盒确定各组总蛋白浓度，然后通过蛋白定量结果上样、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulate（SDS）-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）、轉膜。用丽春红染色检测转膜是否成功。封膜及孵育抗体、显色拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，若符合正态分布，2组间比较采用配对样本t检验，3组以上选择单因素方差分析，若不符合正态分布，则采用秩和检验。计数资料用百分率表示，采用χ检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复方黄柏液对细胞的毒性呈浓度依赖性 测得OD值与抑制率结果显示，浓度越高，抑制率越高，即复方黄柏液浓度越高对细胞毒性越大。其IC值为13.499 1 mg/mL。如图1。

2.2 复方黄柏液增强高糖细胞活性 当内皮细胞给予高糖处理后，OD值明显下降，细胞数量减少，细胞活性显著下降（P<0.01）。细胞高糖处理后给予复方黄柏液处理，细胞活性增强（P<0.01）。内皮细胞高糖处理同时给予氯沙坦（20 μmol/L）处理，细胞活性相对高糖处理有一定程度的升高，而此时再给予复方黄柏液（1∶100）处理时细胞活性进一步增强（P<0.01）。见图2。

2.3 复方黄柏液提高高糖细胞迁移能力 与对照组比较，高糖组细胞迁移率出现明显下降（P<0.001）;与高糖组比较，加入复方黄柏液后，细胞迁移率有增长趋势（P<0.05）;但当复方黄柏液浓度为1∶200、1∶400，此2组与高糖组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。高糖组给予氯沙坦（20 μmol/L）处理，细胞迁移较高糖组强（P<0.05），加入复方黄柏液后，细胞迁移能力进一步增强（P<0.01）。见图3。

2.4 复方黄柏液促进细胞成管能力 7个组别在荧光显微镜成像，各组成管能力见图4。与对照组比较，高糖导致细胞管腔数目减少，成管能力减弱（P<0.01）。加入复方黄柏液或氯沙坦后，细胞成管能力较高糖组增强（P<0.05），其中复方黄柏液的浓度增强，成管能力增强，但仍小于对照组。

2.5 复方黄柏液具有促进内皮细胞生长的作用 Western Blotting结果显示高糖导致促血管生成素2（Angiopoietin-2，Ang-2）蛋白水平增加（P<0.01），与较高糖组比较，加入复方黄柏液及氯沙坦的组别出现Ang-2蛋白水平降低（P<0.05）。高糖导致血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）蛋白水平和P-Tie2即磷酸化酪氨酸激酶受体-2（Endothelial-enriched Tunica Interna Endothelial Cell Kinase 2，P-Tie2）蛋白水平下降（P<0.01），而加入复方黄柏液及氯沙坦组别的VEGF和p-tie蛋白水平较高糖组升高（P<0.01）。见图5。

3 讨论

糖尿病足属中医学之“脱疽”，指发于四肢末端，严重时趾（指）节坏疽脱落的一种慢性周围血管疾病。糖尿病足创面处理是目前治疗糖尿病足溃疡最主要的治疗方式之一。常用的创面处理方式有用液体伤口敷料、生长因子进行换药或封闭式负压引流[7]。中医的塌渍法则是在此基础上提供的新选择。塌渍法既无注射或口服给药带来的肝、肾损害，又不会破坏内服药物疗效，具有绿色健康、疗效显著的特点。由于塌渍法有促进炎症消退、去腐、改善疮周微循环，促进肉芽生长的作用，所以塌渍法常被用于糖尿病足的治疗[8]。

复方黄柏液是全国著名骨髓炎专家谢景龙主任医师经过30多年的外科临床经验总结而来，他运用散结排脓、清热解毒的连翘与能解毒疗疮、清热燥湿的黄柏作为君药，选用性苦甘寒，能够清热解毒散结的蒲公英与气味芳香，透达祛邪，具有清热解毒作用的金银花共为臣药来增强连翘、黄柏的排脓、解毒之功;蜈蚣具有通络散结、退炎治疮的功效。用量虽小却能增强破血逐瘀功效。诸药合用，有清热解毒、消肿排脓、去腐生肌之功。中医学认为脱疽在湿热毒盛，热盛肉期开始出现破溃，这个时期应该要用清热解毒的药物，而复方黄柏液是由清热解毒药物组成的复方溶剂。复方黄柏液直接作用于患处，易被创面吸收，使腠理开疏，药力直达病所，促进静脉、淋巴回流，改善患处周围微循环，进而对溃疡面起到一个消炎镇痛、促进伤口愈合的作用。李友山等[9]和徐炯[10]将局部应用复方黄柏液涂剂冲洗及浸润作为观察组，用其他的洗剂作为对照组进行疗效观察。结果显示观察组的疗效要优于对照组（P<0.05），证实了复方黄柏液涂剂具有明显促进糖尿病足溃疡愈合的作用，然而复方黄柏液作用于糖尿病足溃疡机制仍不明确。

已有研究证实内皮细胞具有增强血管生成和促进伤口修复的作用，血管生成不足导致的伤口修复能力降低是糖尿病病足溃疡难愈合的重要原因[11]。芦阳和刘宏伟[12]认为内皮细胞通过分泌，诱导自身的增殖参与血管新生。完整的血管形成需要经历内皮细胞被激活，内皮细胞迁移、增殖形成血管周围的基质以及萌芽状結构、环状结构[13]。因此内皮细胞对伤口愈合起到至关重要的作用。本实验选用的是人脐静脉内皮细胞，是血管生成实验的经典模式细胞[14]。根据内皮细胞的生成过程，本研究设计了4个实验，囊括血管生成的增值、迁移、成管基质金属蛋白酶的分泌等过程，旨在挖掘复方黄柏液与血管内皮细胞的关系，找到复方黄柏液治疗糖尿病足的起效原因。

高糖组模拟的是糖尿病患者的细胞情况，高糖组加入药物则反映的是糖尿病足溃疡用药之后的状态，结果显示运用复方黄柏液后的细胞迁移、成管、增殖都比高糖组细胞提高（P<0.05）。在之前的研究表明高糖会诱导血管内皮细胞凋亡，造成血管新生困难[15]。而我们的实验则发现复方黄柏液对内皮细胞的增殖、迁移、成管具有促进作用，进一步说明复方黄柏液能够改善高糖导致的内皮功能障碍。实验中还增加了一组氯沙坦作为参照。管绯等[16]认为氯沙坦能增加血液的供应，改善受损的血液循环情况，促进糖尿病足溃疡的愈合。郑丽丽等[17]实验发现氯沙坦通过影响晚期糖基化终末产物（Advanced Glycation End-products，AGEs）能够减少糖尿病血管病变的发生。单纯使用氯沙坦与氯沙坦、复方黄柏液联合使用结果显示，联合使用的效果比单纯应用氯沙坦要好（P<0.05）。这进一步说明了复方黄柏液对治疗糖尿病足溃疡有明显疗效。血管的生成还要受到多种因子的影响，尤其是受到生长因子的影响，因此生长因子的数量变化也可以侧面反映出血管重建所处的状态。Western Blotting实验选取了内皮细胞重建中的重要因子包括Tie-2、VEGF、Ang-2，通过复方黄柏液对这几种蛋白的影响来观察其对内皮细胞的作用。VEGF诱导血管生成以及血管渗透，在血管生成调节中起着核心作用[18]。梁清月等[19]发现糖尿病足患者的VEGF水平要比血糖正常人低，这也说明VEGF水平变化可以起到评价糖尿病足疗效好坏的作用。VEGF通过内皮特异性受体酪氨酸激酶家族的成员起作用，Tie-2的受体酪氨酸激酶就是成员之一[20]。它是最新发现的血管生成信号通路[21]。p-Tie2即磷酸化的Tie2，是Tie2的活化状态，更能反映血管生成和血管结构的稳定性。因此磷酸化水平越高，血管生成越稳定。在本实验中，VEGF和p-tie蛋白水平升高说明使用复方黄柏液后的内皮细胞出现了一定的生长，也就是证实了复方黄柏能够加速糖尿病足溃疡创面内皮细胞增殖进而促进创面愈合。Benigni等[21]认为血管紧张素系统在高血压的病因和人类心脏和肾脏疾病的病理生理学中起着一定的作用。Ang-2是该系统的核心产物，Ang-2增加血管氧气的产生，并诱导内皮一氧化氮（Nitric Oxide，NO）合成酶脱钩，从而进一步增强血管组织的氧化应激，因而降低了NO的可用性。当NO作用受限时，血管舒张功能也会受到限制[22]。而本研究结果显示Ang-2下降，一氧化氮受限会减弱，其对血管内皮细胞的保护作用得以保留。

综上所述，复方黄柏液通过促进细胞增殖、迁移、成管以及影响蛋白表达水平来实现对糖尿病足溃疡的康复，这为其治疗糖尿病足溃疡提供了理论依据，为进一步找到其治疗靶点提供了实验基础。本研究也存在一些不足之处，未找到复方黄柏液作用于糖尿病足溃疡的通路，从阻断通路的途径来反向证明复方黄柏液对糖尿病足溃疡的作用，目前相关研究报道较少，缺乏验证依据，课题组将在日后深入对复方黄柏液与内皮细胞关系的研究，进一步完善复方黄柏液对血管内皮细胞机制的研究。

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（2020-03-03收稿 本文编辑：王明）

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81973849-H2709）——基于AGEs-bFGF/PDGF-β通路研究中医外治“溻渍法”促进糖尿病足溃疡愈合的分子机制;北京中医药大学2017“青苗人才”计划项目（DZMYS-201701）——中医外治“溻渍法”（复方黄柏液涂剂）调控血管新生作用及其机制研究;北京中医药大学基本科研业务费项目（2016-JYB-JSPY-018）——中药外治干预大鼠自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病溃疡对miRNA-146a的影响

作者简介：陈润铭（1995.08—），女，硕士研究生在读，研究方向：中医外科治疗周围血管疾病，E-mail：chenrm95@163.com

通信作者：李友山（1979.10—），男，博士，副教授，主任医师，硕士研究生导师，研究方向中医外科治疗周围血管疾病，E-mail：lys4626@sina.com