Necdin基因在人骨肉瘤中的表达及其临床意义△

武壮壮，申 振，武太勇，王佳妮，李 健，陈士伟，靳文轩，杨美菊，吕 智*

（1.山西医科大学第二医院，山西太原 030001；2.晋城市人民医院，山西晋城 048000；3.山西医科大学，山西太原 030001）

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于青少年，发病率为3～4例/100万人，其恶性程度高、侵袭性强、复发和转移率高［1～3］，严重影响青少年的健康。近年，随着新辅助化疗及外科技术水平的提高，OS的治疗效果已有明显改善，但局部复发率仍可高达50%，且有15%～20%患者在初诊时已发生影像学可见的肺转移，50%患者在治疗期间出现肺转移，80%发生转移的患者在5年内死亡［4］。肿瘤细胞在人体内的转移大致经过以下几个步骤：（1）肿瘤细胞穿过宿主的血管外基质进入血管内，而后进入血液循环；（2）在血液循环中得以存活；（3）在血液循环中逃逸免疫系统的监视；（4）到合适的靶器官后肿瘤细胞驻足并穿出血管壁；（5）肿瘤细胞粘附在靶器官并且在靶器官的微环境中得以存活；（6）随着细胞的扩增和肿瘤组织的长大，新生的肿瘤位点形成新生血管系统［5］。

以往研究表明，Necdin（NDN）是一种多功能蛋白质，可以直接与DNA结合，发挥转录因子的作用［6］，也可以通过与E2F1、p53等著名的转录因子相互作用调节其转录活性以间接调节转录［7，8］。Chapman和Knowles［9］研究表明，NDN在癌细胞系和原发性肿瘤中都存在下调，这表明NDN可能具有肿瘤抑制作用。本研究旨在探讨骨肉瘤患者组织中NDN是否表达异常及其与临床病理因素和预后之间的潜在相关性。

1 资料与方法

1.1 纳入与排除标准

纳入标准：（1）四肢骨肉瘤；（2）符合美国癌症联合委员会（AJCC）分期II期和Ⅲ期；（3）在本院行新辅助化疗和根治性手术；（4）有活检标本，用于免疫组织化学染色。

排除标准：（1）继发性骨肉瘤；（2）骨外骨肉瘤；（3）骨膜或骨旁骨肉瘤；（4）患者术后未复查,无随访信息。

1.2 一般资料

2009年10月—2019年7月，山西医科大学附属第二医院骨病科收治51例患者，符合上述标准，纳入本研究。其中，男28例，女23例；年龄10～67岁，平均（27.04±17.40）岁。病理诊断为普通型骨肉瘤44例，软骨母细胞型骨肉瘤2例，毛细血管扩张型骨肉瘤2例，巨细胞型骨肉瘤2例，低级别中央型骨肉瘤1例。Ennecking分期，ⅡA期34例，ⅡB期13例，Ⅲ期4例。本研究经山西医科大学第二医院伦理审查委员会的批准［山西医科大学第二医院委员会（2021）YX第（098）号］，均征得患者本人或法定监护人的知情同意。

1.3 治疗方法

先采用切开取活检术，取少量组织进行病检，经病理科两位专家确诊为骨肉瘤。待伤口愈合后2周开始进行新辅助化疗，盐酸表柔比星：100 mg/m2，1次/d，连用3 d；顺铂：20 mg/m2，1次/d，连用5 d；术前化疗2个疗程。然后行瘤段切除假体重建术。瘤体送病检，并检测化疗后肿瘤的坏死率。术后2周伤口愈合后拆线，并开始辅助化疗。术后化疗方案根据病检中得出肿瘤坏死率来确定，如果坏死率＞90%，维持原化疗方案；如果坏死率＜90%，改用异环磷酰胺1.5～2 g/m21次/d，连用5 d；顺铂30 mg/m2，1次/d，连用5 d。

1.4 免疫组织化学检查

制备5 μ的石蜡切片，常规先行HE染色，显微镜下观察细胞形态。然后行免疫组织化学检测，二甲苯脱蜡，乙醇溶液复水，EDTA抗原修复液高压修复。然后，用山羊血清封闭切片，用抗NDN抗体（Santa Cruz）在4℃孵育过夜。次日，切片用PBS洗涤3次，再与生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG（北京中杉金桥，37℃）孵育1 h，滴加SABC，37℃孵育30 min，然后用3，3′-二氨基联苯胺（DAB）溶液（DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司）显影，苏木素溶液短暂染色，盐酸酒精返蓝，中性树胶封片。使用Pannorama MIDI数字载玻片扫描仪和扫描仪控制软件（3DHISTECH,Ltd.，布达佩斯，匈牙利）分析抗NDN染色的强度。

1.5 评价指标

从手术之日到死亡之日或直到2021年3月，对临床结果进行跟踪观察。生存时间定义为从确诊到死于原发肿瘤相关原因的时间跨度。患者术后每3个月复查患肢X线片、胸部CT，每6个月复查全身骨扫描。记录临床病理变量，包括年龄、性别、初始磁共振图像上肿瘤的最大直径、Ennecking分期、局部复发、肺转移。

免疫组化评定采用Image J图像分析系统进行阳性结果判定。NDN分别以胞核中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。将阳性细胞的积分光密度值（integrated optical density,IOD）分为：无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，深棕色为3分。阳性面积百分比（染色面积），髙倍镜（×400）下随机选取5个视野，每个视野计数200个细胞，根据平均阳性细胞百分比分为：0%～25%为1分，26%-50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。两项评分相乘：9＜强阳性≤12分,6＜阳性≤9分，3＜弱阳性≤6分，0≤阴性≤3分。

1.6 统计学方法

应用SAS 9.4软件进行统计分析，使用Graphpad prism 7.0软件统计图绘制。计量资料以±s表示，资料呈正态分布时，采用独立样本t检验或单因素方差分析；资料呈非正态分布时，采用Mannwhitney U检验或Krushal-Wallis H检验。等级资料采用采用Krushal-Wallis H检验。计数资料采用Fisher确切概率法检验。采用Kaplan-Meier法估算生存率及平均生存期，Log-rank检验不同组别生存率的差异，Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 临床结果

本组51例患者均得到随访38以上，随访过程中，局部复发16例，转移33例。末次随访时，无瘤生存10例，带瘤生存5例，死亡36例。术后生存时间最长为78个月，最短者为16个月，绝大多数患者死亡原因为肺转移以后导致的呼吸衰竭，以及出现转移以后的全身恶病质。

按末次随访结局分组（无瘤生存组、带瘤生存组、死亡组）进行比较，结果见表1，三组中年龄、性别、术前瘤体大小、NDN检测差异无统计学意义（P＞0.05）。三组间骨肉瘤患者Ennecking分期比较，死亡组中IIB、III期所占比例明显高于无瘤生存组和带瘤生存组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。死亡组中肺转移率明显高于带瘤生存组和无瘤生存组（P＜0.05）。

2.2 NDN免疫组化结果与分组比较

显微镜下所见见图1，NDN表达主要位于细胞的胞核中。NDN在骨肉瘤组织中的表达率为29.41%（15/51），明显低于瘤旁骨组织阳性表达率80.00%（8/10），两者差异有统计学意义（P=0.002）。

图1 NDN免疫组化染色所见 1a:瘤旁正常骨组织NDN表达呈阳性的细胞，被染成棕色（×40） 1b:高倍镜下瘤旁正常骨组织NDN表达阳性的细胞，细胞核呈棕色，胞质、胞核均被染成深棕色（×400） 1c:骨肉瘤组织NDN表达多呈阴性的细胞，骨肉瘤细胞的细胞质、细胞核呈蓝色（×40） 1d:高倍镜下，可见部分蛋白表达阳性的细胞，胞质、胞核均被染成浅棕色（×400）

按NDN检测阴性与阳性分两组进行临床比较，结果见表2。NDN蛋白表达阴性组的术前Ennecking分期为IIB、III期患者比例显著高于阳性组（P＜0.05）。两组年龄、性别、是否肺转移、肿瘤大小、是否复发、生存结局差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 NDN检测阴性与阳性两组患者资料与比较

2.3 不同组别平均生存时间比较

不同组别平均生存时间比较结果见表3，IIA期、非肺部转移、肿瘤大小＜5 cm、NDN检测阳性骨肉瘤患者平均生存时间显著高于IIB/III期、肺部转移、肿瘤大小≥5cm、NDN检测阴性患者（P＜0.05）。

表3 Kaplan-Meier生存期及对数等级分析结果

不同骨肉瘤组织NDN表达阴性与阳性患者的Kaplan-Meier生存曲线见图2，可见NDN阳性表达患者生存时间显著长于NDN阴性表达患者。

图2 NDN检测阴性与阳性的Kaplan-Meier生存曲线

骨肉瘤患者Cox比例风险回归分析结果见表4，引入水准为0.05，剔除水准为0.1。结果表明，Ennecking分期 （HR=1.530）、肺转移 （HR=4.662）、肿瘤大小（HR=3.398）是生存的危险因素，而NDN阳性（HR=0.207）是生存的保护性因素。

表4 骨肉瘤生存风险的Cox多因素分析结果

3 讨论

目前，骨肉瘤的治疗手段主要是术前化疗，手术治疗，术后化疗，但由于骨肉瘤的组织异质性、遗传不稳定性、局部强侵袭性，大多数患者早期即出现肺转移，预后并不满意。目前关于细胞起源的研究、OS干细胞特征的研究、各种信号传导通路、肿瘤微环境、免疫治疗等领域的深入研究，以及建立更好的疾病模型将会开辟治疗此肿瘤的新思路，最终将会提高 OS 患者的疗效［10］。

NDN是一种生长抑制蛋白，首次在有丝分裂后神经元中被发现［11］。NDN最初被认为是有丝分裂后神经元细胞增殖的抑制因子，由于NDN的构成性和终身表达，导致分化的神经元永久退出细胞周期［12］。编码人类NDN的基因位于染色体15q11上，这是普拉德-威利综合征（Prader-Willi syndrome）的母系印记区域，是以发育迟缓和行为异常为特征的神经遗传学疾病［11］。NDN基因是母系印记的，仅从父亲的等位基因转录，在PWS患者中不表达。NDN是黑色素瘤抗原（MAGE）家族的成员，该家族由60多个共享高度保守的MAGE同源结构域（MHD）的基因组成［13，14］。

Yang等［15］研究发现，NDN在正常卵巢上皮中持续表达，在大多数卵巢癌中表达下调。NDN的重新表达抑制了细胞的生长，降低了细胞的运动性和迁移性。Chapman等［16］的研究发现，在28个膀胱癌细胞系中有26个（92.9%）和58个膀胱癌肿瘤中有35个（60%）NDN转录本下调，并观察到端粒酶催化亚单位hTERT可诱导正常人尿路上皮细胞NDN表达下调。膀胱癌细胞系和肿瘤提示NDN可能是肿瘤抑制基因。Hoek等［17］研究发现，与正常黑色素细胞相比，NDN在被测试的8个黑色素瘤细胞株中有6个下调，而在黑色素瘤细胞系中的异位重新表达导致了体外生长抑制，NDN的低表达仍然有利于肿瘤的生长，就像其他肿瘤抑制因子所显示的那样。Virani等［18］研究发现，NDN在一些肿瘤中高表达，并且有致癌的作用。NDN在不同的肿瘤中表现出不同的作用，可能与其所在的微环境和细胞环境有关［19］，了解其不同机制，对于NDN在肿瘤方面的研究非常重要。本研究发现，NDN在骨肉瘤组织中表达下调，在正常骨组织中高表达，NDN高表达的骨肉瘤患者，其生存率明显高于NDN低表达的骨肉瘤患者。由此证明NDN在骨肉瘤中扮演着抑癌基因的角色。

骨肉瘤的转移与Notch通路、Wnt/β-catenin信号通路、Src激酶、免疫逃逸、Fas信号通路等有关系［20］。Lee 等［21］研究发现，与正常组织相比，乳腺癌中NDN的表达有所下降，这表明NDN可能发挥着肿瘤抑制因子的作用，NDN表达水平的提高抑制了高度侵袭性小鼠乳腺肿瘤细胞株的转移能力，NDN很可能是作为转录调节因子和转移抑制因子，在种系水平上发挥其影响。本研究应用单因素和多因素生存分析发现，NDN表达、Ennecking分期、肺转移是影响骨肉瘤患者预后的独立因素，这表明NDN也可能通过抑制骨肉瘤的肺转移来提高骨肉瘤患者的生存率。未来的研究方向应该结合临床，将靶点的发现尽早转化为临床可用的新型靶向治疗药物以及加强对联合用药的探索以提高骨肉瘤化疗疗效。此外，提高肿瘤局部化疗药物浓度也可能是一种可行的策略［22］。本研究结果提示，NDN可能作为治疗骨肉瘤肺转移的一个靶点，其低表达是骨肉瘤患者预后不良的潜在指标。