可降解生物塑料的降解微生物筛选、鉴定及降解性能

冯 娟，杨佳玥，杨文婷，杨子琳，李媛媛

（台州科技职业学院 农业与生物工程学院，浙江 台州 318020）

以聚乙烯、聚丙烯为主的传统塑料由于易制造、成本低、化学性质稳定、温度耐受范围广、防水性好等性能，广泛应用于各个领域。但其在自然环境中难以分解，给生态环境造成了严重的破坏，“白色污染”已成为全球性的环境问题。生物可降解塑料特有的生物降解特性对于生态环境保护、减少“白色污染”等方面具有十分重大的现实意义。其中聚乳酸 (Poly lactic acid，PLA)、聚丁二酸丁二酯 (Poly butylene succinate，PBS)、聚己内酯(Poly ε-caprolactone，PCL)化学合成类生物可降解塑料在自然条件下，可以彻底降解成CO2和H2O，目前需求量已经出现井喷现象。

环境因素如pH、温度、湿度、营养等因素的不同对微生物种群和不同微生物的活性具有不同的影响，不同环境的微生物对可降解生物塑料的降解具有不同的作用。虽然上述材料在自然环境下可彻底降解，但在自然环境中降解速率比较缓慢，因此降解周期与效率急需深入的研究。一旦有简单、安全且高效的降解技术产生，势必更进一步推广可降解塑料的应用，减少白色污染对环境的破坏。如何筛选有用的降解微生物和提高其降解速率成为了当前研究的热点之一。

本研究以啮食60 d聚乳酸的黄粉虫幼虫为实验材料，以PLA为唯一碳源固体培养基筛选具有降解可降解塑料能力的微生物，并对其进行菌株形态学观察、生理生化实验、分子生物学分析及降解性能测定，为进一步筛选和优化高效生物塑料降解菌的筛选及研究提供了良好的理论参考价值及丰富了降解生物塑料的菌质资源。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

台州椒江花鸟市场购买的黄粉虫幼虫；100目PLA粉末、350目PLA粉末、100目PCL粉末、100目PBS粉末皆购于东莞市精科高分子材料有限公司。

1.1.2 主要材料和试剂

葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、柠檬酸盐、氢氧化钠等试剂购置于国药集团药业股份有限公司；PDA琼脂培养基、高氏培养基、完全培养基、营养肉汤培养基、购于海博生物公司；

1.1.3 培养基及灭菌条件

（1）PLA固体培养基：无机盐1 mL，纯化水1000 mL，琼脂20g，pH调至7，灭菌后，待温度降至45℃左右，加入已灭菌的PLA粉末20g，摇匀，倒平板。PCL固体培养基、PBS固体培养基皆按照此方法进行配置；（2）PLA发酵培养基：无机盐1 ml，纯化水1000 ml，pH调至7，将、PCL、PBS用75%酒精浸泡20 min后，无菌水洗涤3次，置于超净台中，吹干12 h加入上述液体中。上述培养基皆放入121 ℃灭菌15 min。

2 实验步骤

2.1 黄粉虫饲养

黄粉虫饥饿处理 3 d，选取形态大小均匀 200 条，于 25±2℃的环境下饲养，平均分两组，每组各 100只。一组喂养麦麸(对照组)，另外组只喂养350目聚乳酸粉末，其他条件一致，喂养时间持续60 d。

2.2 微生物培养方法

取 PLA 塑料粉末饲养60 d后的黄粉虫幼虫，在超净工作台上将虫体浸泡在75%酒精5 min，无菌蒸馏水冲洗3次，用无菌解剖器具抽取出肠道，放入无菌研钵中，加0.5%无菌NaCl溶液，用研磨棒快速研磨至无颗粒制成黄粉虫肠道微生物提取液，取100μL涂布于筛选培养基上，进行单菌落培养基筛选，3代后为纯种。

2.3 不同营养条件下降解菌生长情况

将筛选菌分别接种在PLA固体培养基、PCL固体培养基、PBS固体培养基、PDA培养基、干酪素培养基、营养琼脂肉汤、牛肉膏蛋白胨、高氏一号、完全培养基、三乙酸甘油酯固体培养基10种体培养基，置于30℃培养箱进行观察记录。

2.4 分子鉴定

将YJY-1培养在PDA平板，采用真菌提取试剂盒提取DNA，用鉴定通用引物(ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC) 扩增分离菌ITS序列，送至上海生物工程有限公司进行测序。将测序结果序列通过NCBI上进行BLAST比对，下载相似度较高的参考序列后使用MEGA7软件内置的Clustalx程序进行序列的多重比对，使用Neighbor-Joining法构建系统发育树，所选模型为Kimura 2-parameter model，Bootstrap重复次数设置为1000次。

2.5 降解菌对不同生物降解塑料的降解率

将PLA 350目粉末、100目PLA 粉末、100目PCL粉末、100目PBS粉末及PLA塑料薄膜用75%乙醇浸泡20 min，无菌水洗涤3次，吹干后，按照每2.0 g每100 ml，接入除无机盐外无其他添加物的发酵液内进行摇瓶实验。另外，PLA塑料薄膜的发酵培养过程中，分别添加2%蛋白胨、2%葡萄糖、各1%的蛋白胨和葡萄糖、2% SDS、2%干酪素、2%明胶的物质。将培养48 h的种子液以2%的接种量接入发酵液中，30℃，转速为160 r/min，设置不添加菌液的发酵条件为空白对照，3个平行，重复3次实验。培养12 d后，收集PLA膜、超声波清洗、65 ℃烘干10 h后准确称重，计为M1，计算每瓶发酵液降解率。

可降解塑料降解率=(2.0-M1)/2.0×100%

3 结果与分析

3.1 菌落形态观察结果与分析

经过分离纯化之后，筛选到的一株能在PLA为唯一营养的平板上生长的菌编号为YJY-1。将YJY-1菌分别接种在如图1所列的不同培养基中，菌落生长形态如图1所示，菌落生长情况如表1所示。

表1 YJY-1菌在不同培养基形成的菌落形态

图1 降解菌YJY-1在不同的固体培养基上的菌落特征

A：PLA无机盐固体培养基；B：PCL无机盐固体培养基；C：PBS无机盐固体培养基上；D：PDA固体培养基；E：干酪素固体培养基；F：营养琼脂肉汤；G：牛肉膏蛋白胨固体培养基；H：高氏一号固体培养基；I：完全固体培养基；J：三乙酸甘油酯固体培养基；

降解菌YJY-1在上述各种培养基培养情况中，完全培养基（图1 G）生长最旺盛，菌落生长速度最快，其次为PDA，主要这些培养基所包含的营养物质比较丰富；在PLA、PCL、PBS为唯一的碳源的固体培养基上培养，其碳源难降解，营养较缺乏导致其生长速率较慢。但在这三种培养基上能够生长，说明降解菌YJY-1能够降解一定的PLA、PCL、PBS塑料，并利用其降解产物合成自身生长；结合其在干酪素与三乙酸甘油酯培养基上生长情况，得出该菌通过蛋白酶促降解机理对这些塑料进行降解，并将其转化成能被自己所消耗的营养物质，以满足其生长所需。

3.2 分子鉴定结果

图2 菌株 PSI-1 基于ITS基因序列的系统发育进化树

Figure 3 Phylogenetic tree of strain PSI-1 based on ITS gene sequence

将菌株YJY-1的ITS序列在NCBI上进行BLAST比对，下载相似度较高的参考序列后使用MEGA7软件内置的ClustalW程序进行序列的多重比对，并构建系统发育树：使用Neighbor-Joining法，所选模型为Kimura 2-parameter model，Bootstrap重复次数设置为1000次。系统发育树基于ITS序列，以菌株NR_121555.1 Toxicocladosporium posoqueriae CPC 19305为外群，将菌株YJY-1与Cladosporium属部分物种一起来重建它们的系统发生关系，从而鉴定分类地位。从系统发育树上可以看出，菌株YJY-1与菌 株 MN950992.1 Cladosporium tenuissimum RL6聚在一个进化发育分支上，且自展支持率为95，两者序列相似性达到了99%以上，并与Cladosporium属其他物种处于不同的分支，从分类上属于一个属但属于不同的种。结合其形状特征，菌株YJY-1为Cladosporium属的Cladosporium tenuissimum。

3.3 降解性能鉴定结果与分析

3.3.1 降解菌对PLA塑料薄膜的降解

降解菌YJY-1在只有塑料薄膜（正常发酵）的条件下，培养16 d，其降解率为9.7%，在不同的营养条件下对PLA塑料薄膜的降解率和干菌量皆不同，如图3所示。其中在2%的葡萄糖添加下，其降解率最高，达12.7%，干菌量达到4.092 g/L，葡萄糖作为易利用碳源，能够促进菌量，导致其降解率提高；其次为2%的蛋白胨添加，降解率为10.4%，其干菌量为1.7g/L；2%的干酪素的添加，降解率9.3%，干菌量为1.38 g/L。1%葡萄糖与1%蛋白胨添加下，降解率为9.9%，菌量为1.25g/L；蛋白胨与干酪素都作为高蛋白营养添加物，对该菌的降解率及菌量的影响水平差不多；在2%SDS条件下，PLA降解率降低为4.64%，菌量也降低到0.29 g/L，表明SDS的添加对菌量及降解率都有抑制作用；在2%明胶的营养条件下，降解率为5.7%，菌量为0.61 g/L，相比正常发酵，其菌量略高，但其降解率下降一半左右，表明明胶对此菌的降解率有抑制作用。

图3 降解菌YJY-1在不同营养条件下对PLA塑料薄膜的降解率

3.3.2 降解菌对不同可降解塑料降解

将PLA 350目粉末、100目PLA 粉末、100目PCL粉末、100目PBS粉末，PLA塑料薄膜各粉末按照每2.0 g/100ml，2%的接种量，经过16d的发酵培养，如图4，其中100目PBS粉末降解率最高，可达39.8%；其次为100目PLA粉末降解率30.7%；350目PLA粉末降解率为23.3%；100目的PCL粉末降解率21.3%。如图4所示，PLA相关的粉末降解率远大于聚乳酸塑料薄膜，聚乳酸粉末制成塑料薄膜过程经过拉伸、吹塑、添加增韧剂等工艺，减少与微生物的接触面，加大了微生物对PLA塑料薄膜的降解难度；另外，不同的可降解材料结构与物质组成不同，其降解率也不同，PBS可降解塑料最容易被微生物降解。

图4 降解菌YJY-1对不同可降解塑料的降解性率

4 结论

极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum)属半知菌亚门丝孢纲丛梗孢目暗色孢科枝孢属（Cladosporium）真菌，是植物致病菌，在植物病害有较多报道，偶尔引起人体感染。Cladosporium tenuissimum能够合成茶黄素，湖北农业大学于2008年、2009年申请了关于极细枝孢霉生物合成茶黄素(Theaflavins，TFs)粗提物的方法，.SYED NASEER[11]等人从从印度克什米尔地区喜马拉雅山脉西部分离到一种内生真菌细茎枝孢霉，并对其次生代谢产物进行了分析，首次报道了邻羟基苯基丙酮、(3s，5s，11s)-三羟基十二酸和四氢吡啶酮的天然来源。

目前尚未有极细枝孢霉对可降解塑料具有降解作用的报道，本研究发现的YJY-1具有易培养、生长速度快、降解效率高等优点，具有良好的开发应用潜力。本研究丰富了可降解塑料微生物的菌种资源，为进一步开展可降解塑料生物降解机制研究奠定了重要基础。功能微生物及其分泌的功能酶的高效利用对加速生物可降解塑料的降解具有重要意义，有待寻找更多具有降解塑料材料的微生物及酶，优化降解条件以提高对生物可降解材料的降解效率和速度，推动全球可降解塑料制品的应用。