正交试验法优选盐黄柏的炮制工艺

胡 雨，麻雨乐，高 波，，罗 川，郭志俊，高 巍，张莉梅，王 荣

(1 安徽华润金蟾药业股份有限公司，安徽 淮北 235000；2 华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110)

黄柏是黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮。具有清热解毒，燥湿疗疮的功能和效果。黄柏盐炙后引药入肾，偏于滋阴降火。用于阴虚火旺，盗汗骨蒸[1]。黄柏药材中主要化学成分为黄酮类和生物碱类，其具有降血糖，降血压以及免疫抑制等多种药理作用[2]。在这些化学成分中，小檗碱是黄柏中最主要的有效成分之一，含量可以达到3.0%以上，是黄柏中主要的降血糖和抗炎成分[3]，也是《中国药典》2020版黄柏质量评价的量化指标之一。《中国药典》2020版盐黄柏炮制工艺缺少可控的工艺参数，制备的盐黄柏质量不一。目前，关于盐黄柏炮制工艺研究的文献[3-7]，多以小檗碱和黄柏碱作为评价指标，缺少对盐黄柏标准汤剂出膏率及浸出物的评价。而本研究以小檗碱、黄柏碱、标准汤剂出膏率及浸出物为指标，采用L9(34)正交实验设计，采用L9(34)正交实验设计，考察闷润时间，炒制温度，炒制时间3个因素，优选盐黄柏的炮制工艺，以期可以为盐黄柏的标准化生产提供参考依据。

1 仪器和试剂

1.1 仪 器

Thermofisher型高效液相色谱仪(包括柱温箱、泵、进样器、DAD检测器)；色谱柱Kromasil-100-5-C18(5 μm，4.6 nm×250 nm)、色谱柱Agilent zorbax sb C18(5 μm，4.6 nm×250 nm)、KQ-500E型超声清洗仪；AT系列溶剂过滤器(0.22 μm)，XP26型百万分之一电子天平，梅特勒-托利多有限公司；DFY-300粉碎机，林大机械有限公司。

1.2 试 药

黄柏饮片(批号：200905)；盐酸小檗碱(批号：110713-201212，纯度89.7%)；盐酸黄柏碱(批号：111895-201504，纯度94.9%)；甲醇(色谱纯)；娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈饮料科技有限公司；黄柏样品购买于亳州某公司，经鉴定为药典收载基源黄皮树的干燥树皮。

2 方 法

2.1 小檗碱含量测定

2.1.1 液相色谱条件

C18色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸溶液(50:50)(每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g)为流动相；检测波长为265 nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于4000[1]。见图1。

图1 盐黄柏HPLC(小檗碱)

2.1.2 对照品溶液的制备

取盐酸小檗碱对照品适量，参照《中国药典》(2020版)黄柏药材标准小檗碱含量测定项对照品溶液的制备方法制备对照品溶液，即得[1]。

2.1.3 供试品溶液的制备

参照《中国药典》(2020版)黄柏药材标准小檗碱含量测定项供试品溶液的制备方法制备样品溶液，即可[1]。

2.2 黄柏碱含量测定

2.2.1 液相色谱条件

C18色谱柱；以乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基磺酸钠0.2 g)(36:64)为流动相；检测波长为284 nm。理论板数按盐酸黄柏碱峰计算应不低于6000[1]。见图2。

图2 盐黄柏HPLC(黄柏碱)

2.2.2 对照品溶液的制备

取盐酸黄柏碱对照品适量，参照《中国药典》(2020版)黄柏药材标准黄柏碱含量测定项对照品溶液的制备方法制备对照品溶液，即得[1]。

2.2.3 供试品溶液的制备

参照《中国药典》(2020版)黄柏药材标准黄柏碱含量测定项供试品溶液的制备方法制备样品溶液，即可[1]。

2.3 浸出物含量测定

依照《中国药典》2020版(四部)通则“2201”浸出物测定项下冷浸法对黄柏样品及炮制的盐黄柏样品的醇溶性浸出物进行测定。参照《中国药典》一部“黄柏”项下浸出物含量规定：应不低于14.0%。

2.4 标准汤剂出膏率的测定

2.4.1 标汤制备参数考察

基于《配方颗粒技术要求》(意见稿)制定盐黄柏标准汤剂实验方案[8]。按照盐黄柏的药性及用药部位(皮类)选择煎煮参数，对加水量(倍数)的要求“煎煮开始时的用水量一般以浸过药面2～5 cm为宜”进行考察，确定了盐黄柏标准汤剂加水量及煎煮参数，具体参数见表1。

表1 盐黄柏标准汤剂参数表

2.4.2 不同工艺盐黄柏标准汤剂的制备

取表4中各工艺盐黄柏样品约100 g，参照盐黄柏标准汤剂参数表(表1)及文献[9]中方法制备不同工艺盐黄柏的标准汤剂。

2.4.3 出膏率测定

取合并水煎液约50 g，精密称定，参照文献[9]中出膏率的测定方法对表4中不同工艺条件下的样品出膏率进行测定。

2.5 正交试验

2.5.1 盐黄柏工艺的正交试验设计

基于盐黄柏加工文献检索综述[3-7]及单因素考察，利用L9(34)正交设计，考察闷润时间(A)、炒制温度(B)、炒制时间(C)3个因素，以小檗碱、黄柏碱、浸出物、标准汤剂出膏率为指标，优选盐黄柏的炮制工艺。各因素水平见表2。

表2 正交设计因素水平表

2.5.2 综合评分标准

为了更准确地反映盐黄柏炮制工艺中各因素对其质量的影响。本试验以以小檗碱、黄柏碱、醇溶性浸出物和标准汤剂出膏率为评价指标，用加权平均法计算综合评分[10]。其中小檗碱及黄柏碱权重均为0.3，醇溶性浸出物及标准汤剂出膏率权重均为0.2。综合的评分=小檗碱加权评分+黄柏碱加权评分+浸出物加权评分+出膏率的加权评分[11]。各指标评分见表3，实验安排及结果见表4，方差分析详见表5。

表3 指标加权评分表

表4 正交试验结果及分析

表5 综合评分方差分析

直观分析的试验结果由表4 的极差(R)可以看出：在黄柏盐炙的正交试验设定的因素及水平条件下，对综合评分影响大小的因素进行分析，影响由大到小的顺序为 B因素>A因素>C因素。方差分析表明因素B对炮制工艺具有显著性影响，因素A，C对炮制工艺则无显著性影响[12]。所以从直观分析及方差分析的试验结果可得出：盐黄柏的最佳炮制加工工艺为 A3B1C1，即取净黄柏300 g，加入30 g食盐水(盐水浓度为20%)拌匀，闷润1.5 h，放在130 ℃的炒药设备中，炒制时间约为10 min，取出，晾凉，筛去碎屑即可。

2.6 验证性试验

取黄柏丝300 g，按优选的工艺制备盐黄柏样品3份，测定小檗碱、黄柏碱、浸出物及标准汤剂出膏率，验证结果见表6。

表6 验证试验结果

结果表明，采用该优选工艺制备的盐黄柏样品小檗碱、黄柏碱、醇溶性浸出物和标准汤剂出膏率均较稳定，表明该炮制工艺稳定可控。即盐黄柏炮制的最佳工艺为：取净黄柏300 g，加入30 g的食盐水(盐水浓度为20%)混匀，盐水闷润1.5 h，投到130 ℃的炒药机中，炒制约10 min，取出，晾凉，筛去碎屑即可[11]。

3 结 论

中药饮片盐炙过程中，炒制的温度不能够太高，炒制时间不能过长，以免因食盐快速的析出而达不到盐水炙的目的。此外，炒制时温度过高或炒制的时间过长，也会导致药材中的有效成分降低太多[3，5]。文中盐黄柏优选的最佳炒制温度为 130 ℃，这也和文献研究结果相符合。

刘仁俊等[3]优选得出盐黄柏最佳炮制工艺为：盐水的浓度2%左右，闷润时间大约 1.5 h，炒制温度为 100 ℃左右，炒制时间大概 20 min。陈新华等[5]优选的盐黄柏工艺是采用2%浓度的盐水，置于 100 ℃条件下，烘烤 30 min。程中琴等[7]以生物碱总量、3，5-二咖啡酰奎酸、黄柏内酯、异绿原酸B为综合评价指标得出盐黄柏工艺为：闷润1.5 h，放入预热至 180 ℃炒药机翻炒15～20 min。上述文献研究所得工艺各不相同，该研究以小檗碱、黄柏碱、醇溶性浸出物、出膏率结合外观性状等多指标代替单一指标来优选盐黄柏炮制工艺，更科学合理。优选的盐黄柏工艺稳定可行，重现性良好，可在一定程度上为盐黄柏的产业化生产提供参考。