血清外泌体来源的miR-425-5p与帕金森病认知功能障碍的相关性分析

王男，姚玉芳，张福波，苗娜，徐鑫，杨潮萍

1 沧州市中心医院神经内科，河北 沧州 061000；2 沧州市中心医院中医科

帕金森病（PD）是一种进展缓慢的神经退行性疾病，主要表现为静止性震颤、步态异常及认知功能障碍（CD）等。据报道，有25%～30%的PD 患者并发CD，其中10%～20%的患者随病情加重进展为痴呆［1-2］。外泌体中含多种蛋白质和核酸，其作为细胞间信息传递的媒介，介导了PD 发病和进展过程［3］。miR-425-5p 作为微小RNA（miRNA）家族中一员，已被报道与PD相关炎症、神经元凋亡等有关［4］，此外还与阿尔茨海默病中tau 磷酸化和神经元凋亡密切相关［5］。本研究通过分析miR-425-5p 与PD 并发CD 的关系，旨在为PD并发CD的预防和治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入标准：根据《中国帕金森病的诊断标准（2016版）》［6］确诊为PD；年龄55～80岁；配合研究相关检查项目；临床资料完整。排除标准：伴脑血管疾病、阿尔茨海默病及脑部创伤史；严重实质脏器功能异常；精神疾病、血液系统疾病或恶性肿瘤；伴视力、听力或语言表达障碍等。选取2019年4月—2021 年8 月在沧州市中心医院就诊的PD 患者129 例，其中男73 例、女56 例，年龄55～73（63.75±3.85）岁，体质量指数（BMI）为（25.09 ± 3.13）kg/m2；合并糖尿病史24 例，吸烟43 例，饮酒44 例；学历高中及以下54 例，大专及以上75 例；收缩压（SBP）为（137.47±18.03）mmHg，舒张压（DBP）为（84.02±9.83）mmHg；Hoehn-Yahr（H-Y）分期早期45例、中期69例、晚期15例。本研究经沧州市中心医院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 CD 诊断标准 于PD 患者就诊当天，使用MoCA 量表评价其认知功能，该量表包含7 个维度，分别为命名、注意、语言、抽象、视空间与执行、延迟记忆、定向，总分30分（受试者受教育年限≤12年者，总分加1 分）。总分0～9 分为重度，10～20 分为中度，21～26分为轻度，27～30分为正常。

1.3 血清外泌体中miR-425-5p 检测 抽取PD 患者外周静脉血10 mL，用ExoQuick 外泌体快速提取试剂盒（美国SBI 公司）提取血清中的外泌体，用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测miR-425-5p 水平。用TRIzol 试剂提取外泌体中总RNA，紫外分光光度计检测其纯度，用逆转录试剂盒（日本TAKARA 公司）将RNA 反转录为cDNA。用CFX96型实时荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）扩增产物，扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40 个循环。引物序列：miR-425-5p上游：5＇-GGGGAGTTAGGATTAGGTC-3＇，下游5＇-TGCGTGTCGTGGAGTC-3＇；内 参U6 上 游5＇-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3＇；下 游5＇-AACGCTCTCACGAATTTGCGT-3＇。引物序列由上海吉玛制药技术有限公司设计。用2-ΔΔCt法计算miR-425-5p 的相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。用Shapiro-Wilk检验判断计量资料是否服从正态分布，符合正态分布的计量资料以xˉ±s表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验。用Pearson 相关分析miR-425-5p 与MoCA 量表评分的关系；用受试者工作特征（ROC）曲线评价miR-425-5p 判断PD 并发CD 的价值；用Logistic 回归分析miR-425-5p 与PD 并发CD 的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD患者并发CD的情况 129例PD患者中，并发CD 47例，其中轻度41例、中度6例。

2.2 CD与非CD患者临床资料比较 CD患者男25例、女22 例，年龄（63.81 ± 3.65）岁，BMI（24.85 ±3.14）kg/m2，有糖尿病史10例、吸烟史18例、饮酒史21例，学历高中及以下27例、大专及以上20例，SBP（145.04 ± 19.21）mmHg、DBP（84.77 ± 8.13）mmHg，H-Y 分期早期4 例、中期32 例、晚期11 例；非CD 患者男25 例、女22 例，年龄（63.72 ± 3.99）岁，BMI（25.27±3.14）kg/m2，有糖尿病史14例、吸烟史25 例、饮酒史23 例，学历高中及以下27 例、大专及以 上55 例，SBP（133.12 ± 15.86）mmHg、DBP（83.59±10.70）mmHg，H-Y 分期早期41例、中期37例、晚期4例。CD患者高中及以下学历占比、SBP和H-Y 中晚期占比均高于非CD 患者（P均＜0.05），二者年龄、性别、BMI、糖尿病史、吸烟史、饮酒史、DBP水平比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.3 CD 与非CD 患者外泌体miR-425-5p 水平比较 CD患者外泌体miR-425-5p表达量为0.66±0.10，低于非CD患者的0.84±0.13（t=8.379，P＜0.01）。

2.4 PD 患者miR-425-5p 与MoCA 量表评分的相关性 miR-425-5p 与MoCA 量表中语言、抽象、视空间与执行、延迟记忆和总分均呈正相关（r分别为0.339、0.489、0.347、0.555、0.541，P均＜0.01）。

2.5 miR-425-5p 对PD 并发CD 的诊断效能 miR-425-5p 诊断PD 并发CD 的ROC 曲线下面积为0.876（95%CI为0.810～0.943），最佳截断值为0.71，灵敏度和特异度分别为82.98%和87.80%。

2.6 miR-425-5p与PD并发CD的关系 将PD是否并 发CD 作 为 因 变 量，将 饮 酒 史（χ2=3.677，P=0.055）、学历、SBP、H-Y 分期、miR-425-5p 作为自变量（变量赋值：饮酒史无=0，有=1；学历高中及以下=0，大专及以上=1；SBP≤155 mmHg=0，＞155 mmHg=1；H-Y 分期早期=1，中期=2，晚期=3；miR-425-5p≤0.71=0，＞0.71=1；并 发CD 否=0，是=1），纳 入Logistic 回归分析，结果显示，大专及以上学历、miR-425-5p＞0.71 是PD 并发CD 的独立保护因素，SBP＞155 mmHg 是PD 并发CD 的独立危险因素（P＜0.05或＜0.01）。见表1。

表1 PD并发CD影响因素的Logistic回归分析结果

3 讨论

PD 发病人群主要是老年人，随着中国人口老龄化加重，PD 发病率将进一步升高，PD 并发CD 的患者数量势必会随之增长。目前，对于PD 并发CD 患者多采用药物治疗，如卡巴拉汀和左旋多巴片等，可在一定程度上提高患者的认知功能和生活能力，但部分患者治疗获益甚微，预后不佳［7-8］。若在PD 并发CD 早期及时给予干预，可有效抑制病情进展，提高患者生活质量。目前，临床尚缺乏诊断效能高的指标用于早期识别PD 并发CD，本文通过研究miR-425-5p 与PD 并发CD 的关系，以期为PD 并发CD 的早期预防和治疗提供帮助。

既往研究显示，miR-425-5p 与恶性肿瘤如结直肠癌［9］、卵巢癌［10］、非小细胞肺癌［11］及肝细胞肝癌［12］等的发病和进展有关。新近研究发现，miR-425-5p过表达可通过抑制炎症和氧化应激来减弱鱼藤酮诱导的PD 大鼠模型的神经元凋亡、Th 阳性细胞丢失和小胶质细胞活化［4］。此外，在阿尔茨海默病样细胞模型中，miR-425-5p 还可靶向热休克蛋白B8，促进细胞中的tau 磷酸化和神经元凋亡［5］。HU 等［13］报道，miR-425 缺乏可促进PD 小鼠模型的神经元坏死性凋亡和多巴胺能神经变性。miR-425-5p可靶向沉默信息调节因子1/核因子-κB 信号通路抑制缺血性卒中小鼠的小胶质细胞炎症反应和血脑屏障损伤［14］。小胶质细胞在PD 发病进展过程中扮演着双重角色，静息态的小胶质细胞被激活，可释放促炎因子，加重炎症反应；活化的小胶质细胞可释放抗炎因子，修复并保护神经元。本研究结果显示，CD 患者miR-425-5p水平低于非CD患者，提示PD并发CD后miR-425-5p 水平降低。Pearson 相关分析结果显示，miR-425-5p 与MoCA 量表中语言、抽象、视空间与执行、延迟记忆和总分均呈正相关关系，表明miR-425-5p 可能通过影响PD 患者负责语言、抽象、视空间与执行和延迟记忆相关脑部区域功能参与CD 发病。ROC 曲线分析结果显示，miR-425-5p 判断PD 并发CD 的ROC 曲线下面积为0.876，提示miR-425-5p 对PD并发CD有一定的判断价值，可辅助临床决策。

本研究Logistic 回归分析结果显示，miR-425-5p＞0.71 是PD 并发CD 的独立保护因素，推测其原因是外泌体中miR-425-5p水平与脑部氧化应激、tau磷酸化和神经元凋亡等有关，其水平可反映PD患者的脑部结构和功能的病变情况。既往研究结果显示，年龄和受教育程度与PD 患者并发CD 有关［15-16］。本研究结果显示，大专及以上学历是PD 并发CD 的独立保护因素，与既往研究结果相符。本研究未将年龄纳入Logistic 回归分析，其原因在于：一是PD 发病人群主要为老年人，为保证收集到足够多的PD患者进行研究，对年龄做了一定限制；二是为避免影响miR-425-5p分析结果，年龄作为混杂因素，易影响分析结果的准确性；三是本研究中受试者对象年龄分布较为紧密，差异不显著。SHAH 等［17］研究发现，SBP 水平与脑血流关系密切，较高的SBP 可诱发脑结构改变，进而破坏脑组织；随着SBP 升高，脑内β淀粉样蛋白沉积增加，导致CD 发病风险增加。本研究结果显示，SBP＞155 mmHg 是PD 并发CD 的独立危险因素，表明SBP 升高增加了PD 并发CD 的发病风险，提示应重点关注高SBP 的PD 患者，避免其并发CD。

综上所述，血清外泌体来源的miR-425-5p 水平低与PD 并发CD 有关。本研究上存在一定局限性，一是受试对象均来自于同一家医院，且样本量有限，样本选择上可能存在一定偏倚，后续将开展多中心、大样本研究；二是本研究受试对象均为首次确诊的PD 患者，对于已接受治疗的PD 患者，miR-425-5p 是否可用于并发CD 的判断还未可知，有待进一步深入研究。