消化系统多种癌变组织中3种蛋白质的表达谱

王玳玮，王筠，赵宋礼，曾健，胡铭慧，许特，江波涛，，董蕾，盛司潼

1）深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳 518071；2）佛山市三水区人民医院，广东佛山 528100；3）西安交通大学第二附属医院，陕西西安 710003

消化系统肿瘤多具有易侵袭、易转移、易复发和预后差等特征.食道、胃、结肠、直肠、肝脏和胰腺肿瘤的发病率均在恶性肿瘤发病率排名榜的前10位内［1］.这些肿瘤的发病过程是一个多阶段、多步骤的复杂过程，常涉及家族遗传、基因突变与环境因素交互影响.另外，一些地区的特殊饮食习惯，也是造成中国人消化道恶性肿瘤发病率偏高的后天因素之一［2］.

目前，消化道肿瘤的诊断仍以临床特征和病理检查为主要依据.但是由于这些肿瘤的部位多不在体表，极易漏诊与误诊（确诊患者约有70%呈临床Ⅲ和IV 期）.而晚期发现的患者，治疗效果极差，5 年生存率极低［3］.因此，对消化系统恶性肿瘤的早筛、早诊和早治，已是医学科学家们亟需解决的重大问题.

近年来，随着高通量二代测序等高新技术的迅猛发展，肿瘤的分子病理有了长足进步，特别是对于精准诊疗使用的新型生物标志物的研发风起云涌，一大批与消化道恶性肿瘤发生发展相关的生物标志物正不断被发现［2-4］.

在对口腔癌、食管癌和结直肠癌的前期研究中，本研究团队发现编码stomatin 家族蛋白1（stomatin-like protein 1，STOML1）和TATA 序列结合蛋白相关因子 1（TATA-box binding protein associated factor 1，TAF1L）两基因均有可能是具有潜在病理意义的癌基因［4-8］.TAF1L 作为转录辅助因子已在多种肿瘤中发现存在异常表达［9-11］，但是其在肿瘤发病机制的调控功能并不清楚.另外，在乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食管癌、胃癌、肺癌和头颈部肿瘤研究中，发现STOML2基因高表达与癌细胞的增殖、侵袭和转移相关［8，12-15］，而与其同一家族、具有独特的脂质体/胆固醇的转运和运输功能的STOML1 基因对肿瘤发生发展的作用，则甚少被关注.本研究假设STOML1、STOML2 和TAF1L 三种蛋白质对消化系统恶性肿瘤发生发展具有协同促癌作用，运用消化系统6 种恶性肿瘤（食道、胃脏、结肠、直肠、肝脏和胰腺）的组织芯片和染色-洗脱-再染的多重免疫组织化学染色法［16］，检测分析TAF1L、STOML1 和STOML2 蛋白质在多种消化系统恶性肿瘤病变组织中的表达谱水平，并比对与其匹配的癌旁组织中的表达差异.另外，还通过观察多种抗体原位表达有无共定位特征，试图揭示TAF1L、STOML1 和STOML2 蛋白之间可能的分子相互作用关系.

1 材料与方法

1.1 组织标本

组织芯片（DC-Dig00005，US Biomax）购自陕西爱维拉生物科技有限公司，含食道、胃脏、肝脏、胰腺、结肠和直肠6种消化系统恶性肿瘤及相匹配的癌旁正常组织的微阵列（1 例2 点，共60 例120点）.包括食道癌及对应癌旁组织10例，胃癌及其癌旁组织10 例，肝癌及对应癌旁组织10 例，胰腺癌及对应癌旁组织10 例，结肠癌及对应癌旁组织10 例，直肠癌及对应癌旁组织10 例.另外，还包括正常胃组织6例、结肠组织5例、直肠组织2例、胰腺组织3 例和肝组织2 例的散片作为各种对照.组织芯片中每例的临床参数如年龄、性别、临床分期、病灶位置、病理分级、T-tumor、N-node 和M-metastasis（TNM）分类等信息见表1.

表1 组织芯片的患者临床信息Table 1 Clinical characteristics of the patients in tested tissue array

1.2 多重免疫组织化学染色法

运用单一的、特异性一抗和多重免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC），经过反复染色-洗脱-再染色的步骤，可在同一组织芯片上获得多种抗原与抗体的阳性反应结果；一抗孵育的次序依抗原信号由弱到强依次为STOML1、STOML2、TAF1L和MMP9，通过显微镜下拍照、记录、信号评分和数据统计完成.具体步骤如下：

1）将芯片置于60 ℃恒温干燥箱中干燥1 h；

2）将芯片放入松节油（terpentine oil，TO）透明剂浸泡10 min，重复3次；

3）将芯片依次浸泡在体积分数为100%、95%和75%的乙醇中各5 min 后，置缓慢水流中冲洗5 min，完成脱腊；

4）将芯片浸泡于体积分数为3%的H2O2溶液中，孵育30 min；

5）将芯片浸泡于磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中，置水平摇床上慢速洗涤，重复3次，每次5 min；

6）将芯片浸泡于含柠康酐修复液(pH = 7.5)的修复盒，移入已加水温热的蒸锅中央，直接加热30 min进行抗原热修复；

7）待芯片自然冷却后，重复步骤5）；

8）用适量含triton X-100 的磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffered saline triton X-100， PBST；triton X-100 体积分数为0.1%）稀释一抗，再加入体积分数为5%马血清和体积分数为10%的牛血清蛋白，配制成一抗的工作液，滴加至覆盖组织切片，置孵育湿盒中4 ℃过夜，重复步骤5）；

印度消费的石油有多达80%为进口石油，这使得它面对价格波动时比其他进口国更加脆弱。最近几个月，由于卢比贬值导致石油进口价格膨胀，更加剧了其脆弱性。八月，印度政府估算，如果石油价格居高不下，2018/2019财年的进口石油支出将上升至高达260亿美元。

9）在芯片上滴加适量的PV9000 盒（Polink-2 DAB，ZSGB-BIO）试剂2，室温暗室孵育20 min，重复步骤5）；

10）在芯片上滴加适量的PV9000盒试剂3，室温暗室孵育30 min，重复步骤5）；

11）在芯片上滴加适量的3-氨基-9-乙基咔唑（3-amino-9-ethylcarbazole，AEC）显色液（A 液1 滴 +B 液 2 滴 + C 液 1 滴，混匀，加入 1 mL 双蒸水稀释），待阳性切片上出现可靠的阳性信号时终止显色反应，重复步骤5）；

12）将芯片浸泡苏木素中染细胞核，静置10～20 s，然后用缓慢的流水洗涤10 min；

13）用预热60 ℃的甘油明胶封片；

14） 用数字扫片仪（莱卡，Aperio CS2/EM AC20）记录、分析；

15）将芯片浸泡于预热65 ℃的水中，轻柔去除甘油明胶封片；

16）用体积分数为90%的酒精浸泡芯片5～15 min，镜下观察直至洗脱AEC红色信号；

17）重复步骤5）至步骤16），完成第2 个抗体染色.

1.3 免疫组织化学染色评分标准及数据分析

相关蛋白质在组织芯片中的阳性表达结果，采用染色强度积分和阳性细胞占比积分的乘积进行定量分析.定义特异性阴性显色为“-”时，染色强度积分为0；阳性信号为“+”时，染色强度积分为1；阳性信号为“++”时，染色强度积分为2；阳性信号为“+++”时，染色强度积分为3；阳性信号为“++++”时，染色强度积分为4.阳性细胞占比＜10%时，积分为0；阳性细胞占比为11%～25%时，积分为1；阳性细胞占比为26%～50%时，积分为2；阳性细胞占比为51%～76%时，积分为3；阳性细胞占比为77%～100%时，积分为4.规定两者积分之积为0～3为阴性（低表达），大于3为阳性（高表达）.

所有实验数据的定量分析均采用GraphPad Prism 6 软件进行统计学处理，数据统计结果用表示，显著性差异检验两组间分析采用双尾学生t检验（student'sttest）、多组间比较的单因素方差分析检验和卡方检验，以P＜0.05作为阈值，判断其是否具有统计学显著性差异.

2 结果与分析

2.1 在多种消化系统肿瘤组织中STOML1、STOML2及TAF1L蛋白质表达上调

为探究STOML1、STOML2 及TAF1L 蛋白在消化道肿瘤中的表达情况，使用商品化石蜡微型组织芯片，以及运用免疫组织化学染色方法检测癌组织、癌旁组织和正常上皮组织中STOML1、STOML2及TAF1L蛋白质的表达情况.免疫组织化学染色的阳性结果呈现红色或棕红色着色信号.

2.1.1 STOML1 蛋白质在食管癌及肝癌病灶组织中表达上调

经IHC 染色，在6 种消化道肿瘤的部分癌组织及癌旁组织细胞的胞膜、胞浆和胞核可出现棕红色着色的STOML1 阳性信号（图1）.通过计数评分的卡方检验分析，在10 例食管鳞癌及10 例肝癌的癌旁与癌组织比对中，发现STOML1在癌细胞中呈强阳性表达，P＜0.005，具有显著性差异，见图1（a）、（b）、（e）和（f）.此外，图2 染色综合评分结果表明，STOML1 在胃、胰腺、结肠及直肠组织的癌和癌旁组织的表达量无显著性差异，P＞0.05.由此表明，STOML1 蛋白的异常高表达仅与食管癌及肝癌的病变相关，但与胃、胰腺、结肠及直肠癌症病变可能无相关性.

2.1.2 STOML2 在多种消化系统肿瘤组织中表达均上调

多重IHC 染色结果显示，STOML2 在消化系统6种肿瘤的组织中，结果均为阳性；而在癌旁组织中，均为阴性或弱阳性.STOML2 主要在细胞胞浆中表达，如图3.此外，图4 染色综合评分结果表明，在食管、胃脏、肝脏、胰腺、结肠及直肠组织中STOML2 蛋白质表达呈显著上调，P＜0.000 1.由此说明，STOML2蛋白质的异常高表达很可能与消化系统所有癌症的病变密切相关.

图3 免疫组织化学染色显示STOML2蛋白质在消化系统6种癌和癌旁组织中的表达情况Fig.3 STOML2 protein expression in six cancerous and paracancerous tissues of digestive system by immunohistochemical staining

图4 STOML2蛋白质在6种消化系统癌和癌旁组织中的表达评分Fig.4 The intensity scores of STOML2 in six cancerous and paracancerous tissues of digestive system

2.1.3 TAF1L在多种消化系统肿瘤组织中表达上调

多重IHC染色结果还显示，在除胰腺癌以外的5 种消化系统恶性肿瘤的癌组织中，TAF1L 蛋白染色结果均为阳性；而在癌旁组织中，染色结果则为阴性.TAF1L 蛋白定位以胞浆和细胞核染色为主，如图5.此外，图6 染色综合评分结果表明，TAF1L蛋白在食管、胃、肝、结肠及直肠组织中表达呈显著上调，P＜0.005.由此说明，TAF1L蛋白异常高表达很可能与这5种消化道系统恶性肿瘤的癌变密切相关.

图5 免疫组织化学染色显示TAF1L蛋白质在消化系统癌和癌旁组织中的表达情况Fig.5 TAF1L protein expression in six cancerous and paracancerous tissues of digestive system by immunohistochemical staining

图6 TAF1L蛋白质在6种消化系统癌和癌旁组织中的表达评分Fig.6 The intensity scores of TAF1L in six cancerous and paracancerous tissues of digestive system

2.2 在多种消化系统肿瘤组织中MMP9蛋白质与3种蛋白质的共定位表达特征

2.2.1 在多种消化系统肿瘤组织中MMP9表达上调

为进一步研究STOML1、STOML2及TAF1L这3种蛋白质在多种消化道肿瘤发生中的作用机制，检测了肿瘤转移相关的上皮间质转化过程中关键蛋白MMP9的表达情况，结果如图7.由图7可见，多重IHC 染色结果显示MMP9 在食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌及直肠癌这6种消化道肿瘤中均呈高表达.

图7 免疫组织化学染色显示MMP9蛋白质在消化系统癌和癌旁组织中的表达情况Fig.7 MMP9 protein expression in six cancerous and paracancerous tissues of digestive system by immunohistochemiscal staining

2.2.2 在食管癌组织细胞3种蛋白质与MMP9共定位的表达状况

为挖掘STOML1、STOML2 和TAF1L 蛋白在消化系统恶性肿瘤发生发展中的潜能，在这3种蛋白质均异常高表达的食管癌组织中，运用多重IHC法观察 STOML1、STOML2 和 TAF1L 这 3 种蛋白质与肿瘤转移相关的上皮-间叶细胞转化（Epithelialmesenchymal transition，EMT）过程中关键蛋白质MMP9在同一癌细胞中的表达情况，分析它们是否具有相互关联作用.如图8，多重IHC 染色结果显示，STOML1、STOML2、TAF1L 和 MMP9 四种蛋白质在食管癌的同一病灶多个细胞中均呈高表达（图8中箭头所示）.通过计数评分的卡方检验分析，在10例食管鳞癌组织中，这4种蛋白质均呈阳性表达（图8）.由此说明，STOML1、STOML2和TAF1L蛋白质的异常高表达可能与食管癌的病变进展的关键蛋白质MMP9 呈显著正相关；也提示STOML1、STOML2 和TAF1L 这3 种蛋白质可能作为食管癌的早期标志物.

图8 多重IHC染色显示STOML1、STOML2、TAF1L和MMP9蛋白质在同一癌组织细胞中的表达情况Fig.8 STOML1、STOML2、TAF1L and MMP9 protein expressions in the same tumor cells by multiple immunohistochemical staining.(e)-(h)are enlarged images in the square regins of(a)-(d),respectively.

2.3 STOML1和STOML2在细胞中表达呈相关性

通过免疫荧光染色和显微扫描成像技术，在同样高表达STOML1 和STOML2 的结直肠癌细胞系HCT116细胞上，观察到STOML1和STOML2蛋白在这类癌细胞中的共定位情况.在结直肠癌细胞中，STOML1 与STOML2 呈阳性表达的细胞存在着部分共定位的现象，但并不完全重合，具体表现为STOML1 均匀分布在细胞质和细胞核中，而STOML2主要分布在细胞质及细胞膜上（图9）.

图9 免疫荧光染色显示结直肠癌上皮细胞中STOML1与STOML2的共表达状况Fig.9 Co-expression between STOML1 and STOML2 in HCT116 cells by immunofluorescent staining

3 讨 论

通过多重免疫组织化学染色法在多种消化系统恶性肿瘤组织芯片上发现STOML1、STOML2 和TAF1L 三种蛋白质表达谱的组织特异性与泛癌共性，间接表明它们具有可单个或配套用于消化系统恶性肿瘤早期诊疗的潜能.

TAF1L 蛋白质属于一类TATA 盒子结合蛋白，其对应基因位于9p21.1 上，无内含子，作为同源物，TAF1L 蛋白与TAF1 蛋白表现出95%的氨基酸相似度，且都具有乙酰转移酶活性［17］.由于对TAF1L蛋白功能研究的缺乏，目前仅有部分文献发现TAF1L的基因突变与肺癌、胃癌、结直肠癌及尿路上皮癌等肿瘤的发病有关，可具体机制并不明确［4，10-11］.本研究发现除胰腺癌外，在食管癌、胃癌、肝癌、结肠癌及直肠癌组织中TAF1L的蛋白质表达均呈上调. 前期的实验结果还发现，TAF1L蛋白质在口腔鳞癌组织中的表达也是上调的［5-7］.综上所述，TAF1L很可能是一个广谱消化道恶性肿瘤的促癌生物标志物.

STOML1 也称SLP-1，是人类红细胞膜整合蛋白质，属stomatin 家族成员之一. 该家族的蛋白质在进化上属于保守蛋白质，其同源蛋白质广泛存在于包括人类在内的许多物种.迄今为止，已在哺乳动物中鉴定出5 个stomatin 家族成员（STOM、NPHS2、STOML1、STOML2 和 STOML3）［18］.近年来的研究揭示，stomatin 家族成员促进恶性肿瘤的发生发展以STOML2 表现最为突出.STOML2 蛋白质在多种恶性肿瘤癌灶组织中表达异常增高，例如乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、食管癌、胃癌、肺癌和头颈部肿瘤等，其即可能参与了对癌细胞的凋亡和细胞周期的调控，还可能在癌细胞侵袭与转移等方面也起到了重要作用［11-15-19］.但是，STOML1 在恶性肿瘤中的作用研究几无报道. 本研究在食管癌及肝癌组织中，发现STOML1 及STOML2 蛋白质在癌细胞胞浆中存在着共表达的现象（图8）.并经过体外培养结直肠癌细胞的双重免疫荧光共定位分析，发现它们两者虽然在癌细胞胞浆中存在着部分共定位现象，但两者在癌细胞的胞核和胞膜的表达位置并不一致（图9）.这与之前在口腔癌研究发现的结果一致［8］. 由此提示，STOML1及STOML2可能也存在各自不同的功能使命，可以通过影响不同的信号通路调控不同的消化系统肿瘤的发病机制.

与匹配的同一患者癌旁正常上皮组织比较，在6种消化系统肿瘤（食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌和直肠癌）癌灶组织STOML2蛋白质的表达水平呈显著性升高（P＜0.001）.另外，除胰腺癌外，TAF1L在另外5种消化道癌症组织中蛋白质的表达水平呈明显升高（P＜0.01）.虽然，曾发现STOML1在口腔癌中的异常表达与病理分级有关［8］，但是在本研究多种消化系统恶性肿瘤组织切片的多重免疫组织化学染色显示，它具有组织特异性，仅在食管癌和肝癌组织中表达量明显升高.与此同时，在食管鳞癌同一个病灶组织中，STOML1、STOML2、TAF1L 及MMP9（上皮细胞向间质细胞转化的关键蛋白质）表现为在同一癌细胞的胞浆中均呈现高表达，这可能提示这3个蛋白质均具有促癌作用，并具有组合配套成为消化道肿瘤新型分子标志物的潜能.同时，还说明它们在消化系统癌细胞侵袭与转移等方面可能也具有重要作用.

结 语

通过对3种蛋白质STOML1、STOML2和TAF1L的表达谱分析，揭示了它们各自或协同与消化系统多种恶性肿瘤的病变进展相关，可研发其单独或组合成为这些肿瘤早期或辅助诊断的分子标志物.另外，STOML1、STOML2 和TAF1L 蛋白质与MMP9在同一癌细胞的共表达现象，也提示它们在癌变具体的分子调控机制值得深入研究.