两株海南红树植物内生真菌的生物活性成分

陈必婷，吴炜城，周董董，邓小林，张世清，袁靖喆，徐静，郭志凯 ，3

1）海南大学化学工程与技术学院，海南海口 570228；2）海南省热带微生物资源重点实验室，中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 571101；3）海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室，中国热带农业科学院海南热带农业资源研究院，海南海口 571101

红树林是生长在热带、亚热带入海口潮间带的木本植物群落，具有耐盐、耐高温、耐强紫外线和厌氧等特性［1］.为适应严酷的生存环境，红树植物的内生真菌能够产生结构新颖及生物活性多样的代谢物协助红树抵御外来威胁，因而红树植物被称为天然药物研发的宝库［2］.已有研究表明，Phomopsis属和Aspergillus属的内生真菌能够产生具有抗菌、抗炎和免疫等活性的结构新颖的化合物，主要包括生物碱、黄酮、蒽醌、环二肽、聚酮和香豆素类等［1，3］.为从红树植物内生真菌中寻找具有重要价值的新型（药用）先导天然产物，本研究对两株红树植物内生拟茎点霉真菌Phomopsissp. DHS11和烟曲霉真菌Aspergillus fumigatusJRJ111048 的发酵产物进行分离，获得9 种单体化合物.通过高分辨质谱、一维和二维核磁共振波谱、旋光以及文献数据比对等方法，对9种化合物进行化学结构鉴定和生物活性评价.

1 材料与方法

1.1 实验材料和设备

一维核磁共振谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）包括氢核磁共振谱（1H-NMR）和核磁共振碳谱（13C-NMR）；二维谱包括异核单量子相 关（heteronuclear single quantum correlation，HSQC）、异核多键相关（heteronuclear multiple bond correlation，HMBC）和氢氢质子同核相关谱（1H-1H correlated spectroscopy，1H-1H COSY）和旋转坐标系二维差谱（rotating frame overhauser effect spectroscopy，ROSEY）数据在Bruker AV-500 型超导核磁仪（德国Bruker 公司）测定；高分辨电喷雾质谱（high resolution electrospray ionization mass spectroscopy，HRESIMS）数据由布鲁克质谱仪（Bruker amazon SL）测定；紫外数据由紫外光谱仪（Shimadzu UV-2550）测定；红外数据由红外光谱仪（Nicolet 380，美国Thermo Fisher 公司）测定；旋光数据由旋光仪（MCP 5100，奥地利Anton Paar 有限公司）测定；以四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS）为内标；旋转蒸发仪购自日本东京理化器械株式会社；色谱硅胶板G和柱层析硅胶（硅胶颗粒粒径分别为200～300 μm和60～80 μm）购于青岛海洋化工厂；Sephadex LH-20 和十八烷基硅烷键含硅胶填料（octadecylsilyl，ODS）反相硅胶分别购自瑞典PharmaciaBiotec公司和日本京都Nacalai Tesque；半制备高效液相色谱仪配备C18反相柱（250.0 mm×10.0 mm，填料颗粒粒径为5 μm）；实验所用的试剂为分析纯或色谱纯.

1.2 实验方法

1.2.1 菌株发酵

红树植物内生真菌Phomopsissp. DHS11 和Aspergillus fumigatusJRJ111048 分别经过马铃薯葡萄糖培养基平板（马铃薯浸出粉200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂15 g/L和氯霉素0.1 g/L）活化，于28 ℃培养6 d 后，直接将菌块接种于大米培养基中，置于28 ℃的菌株发酵室中发酵35 d.

1.2.2 化合物的分离和纯化

真菌Phomopsissp. DHS11发酵完成后，用等体积乙酸乙酯浸泡提取3 次，每次间隔24～48 h，提取液经旋转蒸发仪减压浓缩得到100 g 浸膏.将浸膏经减压硅胶柱，用二氯甲烷和甲醇溶液梯度洗脱（体积比依次为100∶0、100∶1、100∶2、100∶4、100∶8、100∶16、100∶32、100∶64 和0∶100），得到11 个组份，依次记作组份1～11（Fr.1—Fr.11）.经正相硅胶柱梯度洗脱（二氯甲烷和甲醇的体积比为100∶0～100∶8），Fr.5（二氯甲烷和甲醇的体积比为100∶2）可得到8 个组分（Fr.5.1—Fr.5.8）.对Fr.5.4 进行Sephadex LH-20凝胶柱层析（流动相为纯甲醇）和重结晶法，得到化合物1（质量为11 mg）.Fr. 5.2 经反相硅胶柱色谱（甲醇水溶液体积分数为20%～80%）、Sephadex LH-20 凝胶柱层析（流动相为纯甲醇）和半制备高效液相色谱处理，可得到化合物3（质量为6 mg，保留时间tR=16 min）.对Fr.7（二氯甲烷和甲醇体积比为100∶4）进行正相硅胶柱（二氯甲烷和甲醇体积比为100∶0～100∶16）梯度洗脱，共得到10 个组分Fr.7.1—Fr.7.10，再经反相硅胶柱色谱（甲醇水溶液体积分数为30%～80%）和Sephadex LH-20凝胶柱层析（流动相二氯甲烷和甲醇的体积比为1∶1）处理，可从Fr.7.3 得到化合物2（质量为15 mg）和化合物6（质量为20 mg）.对Fr. 8（二氯甲烷和甲醇的体积比为100∶4～100∶8）进行正相硅胶柱（二氯甲烷和甲醇体积比为100∶2～100∶32）梯度洗脱处理，可得到8个组分（Fr. 8.1—Fr. 8.8），再经Sephadex LH-20 凝胶柱层析（流动相为纯甲醇），可从Fr.8.3 和Fr. 8.4 分别得到化合物9（质量为3 mg）及化合物4（质量为10 mg）.

真菌Aspergillus fumigatusJRJ111048 发酵完成后，经等体积乙酸乙酯提取得到约10 g浸膏，进一步通过正相硅胶柱层析（梯度洗脱，二氯甲烷和甲醇体积比分别为 100∶0、100∶1、100∶2、100∶4、100∶8、100∶16、100∶32、100∶64 和 0∶100），可得到11 个组份（Fr. A—Fr. K）.经正相硅胶柱和Sephadex LH-20凝胶柱层析，可从Fr.D（二氯甲烷和甲醇体积比为100∶4）得到化合物5（质量为10 mg）.经正相硅胶柱、反相硅胶柱色谱和Sephadex LH-20凝胶柱层析，可从Fr.C（二氯甲烷和甲醇的体积比为100∶2）得到化合物7（质量为2 mg）和化合物8（质量为2 mg）.

1.2.3 生物活性测试

对分离获得的所有化合物进行活性筛选，通过CCK-8 法［4］测试脾细胞毒性，Con A 诱导的脾细胞增殖实验和抗肿瘤活性测定方法分别参考文献［5-6］.

2 结果与讨论

本研究从两株红树植物内生真菌Phomopsissp. DHS11和Aspergillus fumigatusJRJ111048的大米固体发酵产物中分离纯化得到9 种化合物，经鉴定分别为norpestaphthalides C(1)、norpestaphthalide A (2-a)、 norpestaphthalide B (2-b)、 7-hydroxy-3-(2-hydroxy-propyl)-5-methyl-isochromen-1-one(3)、alternaroside B (4)、cytochalasin B (5)、cerevisterol (6)、5-hydroxymethyl-furaldehyde(7)、N-(4-hydroxyphenethyl)acetamide (8) 和 3, 5-dihydroxybenzoic acid (9)，对应结构如图1.

图1 化合物1～9的结构Fig.1 Structures of 9 compounds

化合物1 为首次发现的新苯并呋喃酮类化合物，化合物4是首次从Phomopsissp. 属真菌中分离得到的脑苷脂类化合物.体外生物活性评价发现细胞松弛素类化合物5具有良好的免疫抑制活性.

2.1 结构鉴定

化合物1 为白色晶体，用MeOH 将化合物1 溶解，测得旋光值（［α］）为+ 40.0，浓度c= 0.10 mol/L，紫外最大吸收波长λmax分别为228、261和293 nm，摩尔吸收系数lgε分别为2.82、2.95和2.64；红外（溶剂为KBr）最大吸收波数υmax分别为3 422、1 706、1 606、1 359、1 491、1 304、1 160 和1 066 cm-1；圆二色谱（circular dichroism，CD，c= 0.05 mol/L，溶剂为MeOH）λma（x吸收率差值Δε）分别为204（+0.39），212（-4.50）、227（-0.70）、261（+0.39）和289（-0.46）nm.负源HRESIMS 测得化合物的准分子离子峰质荷比m/z= 223.061 3［MH］-.推出化合物1 的分子式为C11H12O（5C11H11O5的分子量理论值为223.061 2），不饱和度为6.化合物1与文献［7］中化合物2的结构相似，差别为化合物1 上的C-7 连接甲氧基.由13C-NMR（表1）和DEPT135谱可知，化合物1含有5个季碳（碳的化学位 移δC分 别 为 167.5、 164.8、 159.1、 152.7 和105.1）、2 个甲基（δC为55.5 和18.5）和4 个次甲基（δC为 101.3、99.1、81.8 和 66.3）；从化合物 1的1H-NMR 谱推测该化合物含有1 个甲基质子，氢的化学位移δH=1.04（多重峰d，耦合常数J=6.4 Hz，3H），1个甲氧基质子δH=3.81（s，3H），两个苯环上的间位质子信号δH分别为6.51（d，J= 1.6 Hz，1H）和6.41（d，J=1.6 Hz，1H），两个羟基质子（δH为4.96和10.61）和两个次甲基质子δH为4.04（qd，J= 6.4，2.9 Hz，1H）和5.19（d，J= 2.9 Hz，1H）.根据上述核磁数据推出的氢、碳数量与质谱数据推出的一致.根据化合物的1H-1H COSY 谱（图2）可知，H-9和H-8相关，H-8和H-3相关.综合分析化合物 1 的 HSQC 和 HMBC 谱可知，H-9 与 C-3、C-8 相关，H-8 与 C-3 相关，H-3 与 C-4、C-1、C-7a相关，H-4 与 C-5、C-6、C-7、C-7a、C-3 相关，H-6 与 C-4、C-5、C-7、C-7a、C-1 相关，H-11 与 C-7相关；同时，根据HMBC和ROSEY（图2）相关信号可确定甲氧基和羟基的位置.上述结构片段连接整理后即可推出化合物的平面结构.通过比较文献［8-9］中类似化合物的相关碳谱数据、电子圆二色谱（electrostatic circular dichroism，ECD）数据和比旋光度，与已知化合物norpestaphthalide A（化合物2-a）的相关数据是一致的，由此推出，化合物1中C-3和C-8的绝对构型为3S和8S.因此，确定化合物1 为新苯并呋喃酮类化合物，命名为norpestaphthalide C（图1）.根据化合物1 的二维核磁谱图（HSQC、HMBC 和1H-1H COSY），可得该化合物的核磁数据如表1.

图2 化合物1 的1H-1H COSY（粗线）、HMBC（单箭头）和ROESY（双箭头）相关Fig.2 Key 1H-1H COSY(bold lines),HMBC(single arrows)and ROESY(double arrows)correlations of compound 1

表1 化合物1的1H-NMR（500 MHz）和13C-NMR（125 MHz）数据（DMSO-d6）Table 1 1H-NMR（500 MHz）and 13C-NMR（125 MHz）spectral data for compound 1 in DMSO-d6

化合物2-a为淡粉色固体，正源HRESIMS测得其准分子离子峰m/z=233.045 1［M+Na］+，推导其分子式C10H10O5（C10H10O5Na 的分子量理论计算值为233.042 0）.化合物 2-a 的1H-NMR 数据（DMSO-d6，500 MHz）δH分别为 10.39（s，1H）、10.39（s，1H）、6.37（s，1H）、6.28（s，1H）、5.14（d，J= 3.0 Hz，1H）、4.94（d，J= 5.2 Hz，1H）、4.02（td，J= 6.0、3.3 Hz，1H）和1.04（d，J=6.4 Hz，3H）.13C-NMR数据（DMSO-d6，125 MHz）δC分别为 168.1（C，C-1）、81.8（CH，C-3）、152.2（C，C-3a）、102.4（CH，C-4）、157.9（C，C-5）、100.9（CH，C-6）、164.2（C，C-7）、104.3（C，C-7a）、66.4（CH，C-1'）和 18.5（CH3，C-2'）.综合分析化合物2-a的氢谱和碳谱数据，并与文献［8］数据进行对比，确定一致，故鉴定化合物2-a为norpestaphthalide A.

化合物2-b为淡粉色固体，正源HRESIMS测得其准分子离子峰m/z=233.045 1［M+Na］+，推出分子式C10H10O5（C10H10O5Na 的分子量理论值为233.042 0）.化合物2-b 的1H-NMR 数据（DMSO-d6，500 MHz）δH分别为10.39（s，1H）、10.39（s，1H）、6.40（s，1H）、6.30（s，1H）、5.20（d，J=5.5 Hz，1H）、5.09（d，J= 4.7 Hz，1H）、3.81（m，1H）和1.01（d，J= 6.3 Hz，3H）.13C-NMR 数据（DMSO-d6，125 MHz）δC分别为168.0（C，C-1）、82.5（CH，C-3）、152.0（C，C-3a）、102.5（CH，C-4）、158.0（C，C-5）、101.3（CH，C-6）、164.3（C，C-7）、103.6（C，C-7a）、67.8（CH，C-1'）和18.1（CH3，C-2'）.综合分析化合物2-b的氢谱和碳谱数据，并与文献［8］的数据进行对比，确定一致，故鉴定化合物2-b为norpestaphthalide B.

化合物3为棕色油状，负源HRESIMS测得其准分子离子峰m/z=233.081 9［M-H］-，推出分子式为C13H14O（4C13H13O4的分子量理论值为233.081 1）.根据核磁图谱可知该化合物1H-NMR 数据（DMSO-d6，500 MHz）δH分别为：6.60（d，J=2.4 Hz，1H）、6.58（d，J= 2.3 Hz，1H）、5.95（s，1H）、4.84（s，1H）、4.02（m，1H）、2.64（s，3H）、2. 56（m，2H）和1.14（d，J=6.2 Hz，3H）.13C-NMR数据（DMSO-d6，125 MHz）δC分别为：178.3（C，C-1）、164.7（C，C-3）、111.5（CH，C-4）、114.2（C，C-4a）、141.3（C，C-5）、116.7（CH，C-6）、161.0（C，C-7）、100.6（CH，C-8）、159.3（C，C-8a）、42.9（CH2，C-9）、64.1（CH，C-10）、23.4（CH3，C-11）和22.4（CH3，C-5）.综合分析化合物3的氢谱和碳谱数据，并与文献［10］的数据进行对比，确定一致，故鉴定化合物3为7-hydroxy-3-（2-hydroxy-propyl）-5-methyl-isochromen-1-one.

化合物4为白色粉状，根据测试得到的核磁图谱可知该化合物的1H-NMR 数据（DMSO-d6，500 MHz）δH分别为 7.38（d，J= 9.4 Hz，1H）、5.77（d，J=4.9 Hz，1H）、5.67（dt，J分别为14.3 Hz和6.7 Hz，1H）、5.56（dt，J分别为 15.6 Hz 和 6.2 Hz，1H）、5.43（dd，J分别为 15.4 Hz 和 5.5 Hz，1H）、5.36（dd，J分别为15.4 Hz 和6.8 Hz，1H）、5.08（m，1H）、4.97（d，J= 4.2 Hz，1H）、4.92（m，3H）、4.52（t，J= 5.8 Hz，1H）、4.29（t，J=5.3 Hz，1H）、4.11（d，J=7.8 Hz，1H）、3.97（d，J=6.8 Hz，1H）、3.95（s，OH）、3.78（tt，J分别为9.1 Hz 和4.9 Hz，1H）、3.66（ddd，J分别为11.8、6.0 和1.9 Hz，1H）、3.51（m，1H）、3.43（dt，J分别为11.5 Hz 和5.8 Hz，1H）、3.13（td，J分别为8.7 Hz 和4.8 Hz，1H）、3.08（ddd，J分别为7.8、5.7 和 1.7 Hz，1H）、3.03（td，J分别为 8.9 Hz 和5.0 Hz，1H）、2.95（td，J分别为8.3 Hz 和4.2 Hz，1H）、1.93（dt，J分别为 19.4 Hz 和7.4 Hz，8H）、1.54（s，3H）、1.23（s，36H）和 0.85（t，J= 6.6 Hz，6H）.13C-NMR 数据（DMSO-d6，125 MHz）δC分别 为 68.6（CH2，C-1）、52.9（CH，C-2）、70.5（CH，C-3）、131.0（CH，C-4）、130.9（CH，C-5）、27.4（CH2，C-6）、32.2（CH2，C-7）、123.5（CH，C-8）、134.9（qC，C-9）、39.1（CH2，C-10）、27.3（CH2，C-11）、29.1（CH2，C-12、C-13 和 C-14）、28.7（CH2，C-15）、22.1（CH2，C-16）、13.9（CH3，C-17）、15.7（CH3，C-18）、172.1（qC，C-1'）、71.9（CH，C-2'）、129.1（CH，C-3'）、130.9（CH，C-4'）、31.7（CH2，C-5'）、29.0（CH2，C-6'至 C-15'）、31.3（CH2，C-16'）、22.1（CH2，C-17'）、13.9（CH3，C-18'）、103.5（CH，C-1″）、73.4（CH，C-2″）、76.6（CH，C-3″）、70.0（CH，C-4″）、76.9（CH，C-5″）和61.1（CH，C-6″）.综合分析化合物4的氢谱和碳谱数据，并与文献［11］的数据进行对比，确定一致，故鉴定化合物4为alternaroside B.

化合物5为白色晶体，正源HRESIMS测得其准分子离子峰m/z=502.260 6［M+Na］+，推出分子式C29H37NO（5C29H37NO5Na的分子量理论值为502.256 4）.根据核磁图谱可知，该化合物的1H-NMR 数据（DMSO-d6，500 MHz）δH分别为：8.29（s，1H）、7.27（t，J= 7.5 Hz，2H）、7.19（m，1H）、7.11（2H，m）、6.77（dd，J分别为15.6 Hz 和4.3 Hz，1H）、5.82（ddd，J分别为 15.1、9.7 和 1.7 Hz，1H）、5.71（dd，J分别为15.6 Hz 和1.8 Hz，1H）、5.12（d，J= 1.6 Hz，1H）、5.03（ddd，J分别为14.8、10.8 和3.6 Hz，1H）、4.88（m，2H）、4.38（dp，J分别为5.0 Hz 和2.3 Hz，1H）、3.61（d，J= 10.7 Hz，1H）、3.23（d，J=10.3 Hz，1H）、3.20（d，J=3.4 Hz，1H）、3.01（t，J=6.5 Hz，1H）、2.77（dd，J分别为13.2 Hz 和5.0 Hz，1H）、2.68（dd，J分别为5.4 Hz 和2.3 Hz，1H）、2.62（dd，J分别为13.2 Hz 和7.4 Hz，1H）、2.01（dp，J分别为11.4、3.4 和2.9 Hz，1H）、1.80（ddd，J分别为13.9、8.7 和6.0 Hz，1H）、1.61（ddd，J分别为15.0、10.1 和4.0 Hz，1H）、1.54（m，1H）、1.43（ddd，J分别为13.7、10.2 和 3.1 Hz，1H）、1.35（ddd，J分别为13.2、8.8和5.3 Hz，1H）、1.24（s，1H）、1.15（m，1H）、0.87（dd，J分别为6.6 Hz 和4.5 Hz，1H）、0.84（d，J= 6.6 Hz，3H）、0.62（d，J= 6.7 Hz，3H）和 0.49（dtd，J分别为 13.0、10.8 和 5.1 Hz，1H）.13C-NMR 数据（DMSO-d6，125 MHz）δC分别为170.8（CH，C-1）、52.4（CH，C-3）、46.5（CH，C-4）、31.1（CH，C-5）、151.0（C，C-6）、68.6（CH，C-7）、47.5（CH，C-8）、83.4（C，C-9）、42.9（CH2，C-10）、13.3（CH3，C-11）、112.4（CH2，C-12）、128.3（CH，C-13）、41.8（CH，C-14）、41.8（CH2，C-15）、33.0（CH，C-16）、34.4（CH2，C-17）、20.1（CH2，C-18）、35.0（CH2，C-19）、68.6（CH，C-20）、153.4（CH，C-21）、118.1（CH，C-22）、164.2（C，C-23）、20.4（CH3，C-24）、137.1（C，C-1'）、129.8（CH，C-2'和C-6'）、128.6（CH，C-3'和C-5'）和126.5（CH，C-4'）.综合分析化合物5 的氢谱和碳谱数据，并与文献［12-13］数据进行对比，确定一致，故鉴定化合物5为细胞松驰素B.

化合物6为白色粉状，根据测试得到的核磁图谱可知，该化合物的1H-NMR 数据（DMSO-d6，500 MHz）δH分别为：5.23（dd，J分别为 15.3 Hz 和7.2 Hz，1H）、5.17（dd，J分别为 15.3 Hz 和 8.1 Hz，1H）、5.08（m，1H）、4.51（d，J= 5.5 Hz，1H）、4.24（d，J=5.6 Hz，1H）、3.76（m，1H）、3.60（s，1H）、0.99（d，J= 6.6 Hz，3H）、0.90（s，3H）、0.88（d，J= 6.8 Hz，3H）、0.81（d，J= 6.3 Hz，3H）、0.79（s，3H）和0.55（d，J= 10.9 Hz，3H）.13C-NMR 数 据 （DMSO-d6，125 MHz）δC分 别 为 ：31.2（CH2，C-1）、32.5（CH2，C-2）、66.0（CH，C-3）、40.2（CH2，C-4）、74.5（C，C-5）、72.1（CH，C-6）、119.5（CH，C-7）、139.7（C，C-8）、42.3（CH，C-9）、36.7（C，C-10）、21.4（CH2，C-11）、39.0（CH2，C-12）、43.0（C，C-13）、54.2（CH，C-14）、22.6（CH2，C-15）、27.8（CH2，C-16）、55.3（CH，C-17）、12.1（CH3，C-18）、17.7（CH3，C-19）、40.1（CH，C-20）、21.0（CH3，C-21）、135.4（CH，C-22）、131.4（CH，C-23）、42.0（CH，C-24）、32.5（CH，C-25）、19.8（CH3，C-26）、19.5（CH3，C-27）和17.3（CH3，C-28）.综合分析化合物6 的氢谱和碳谱数据，并与文献［14］的数据进行对比，确定一致，故鉴定化合物6为啤酒甾醇.

化合物7为不定型粉状，根据测试得到的核磁数据可知其1H-NMR（CD3OD，500 MHz）δH分别为：9.52（s，1H）、7.37（d，J= 3.5 Hz，1H）、6.57（d，J= 3.5 Hz，1H）和 4.60（s，2H）.13C-NMR 数据（CD3OD，125 MHz）δC分别为：179.6（CH，C-1）、163.4（CH，C-2）、125.2（CH，C-3）、111.0（CH，C-4）、154.1（C，C-5）和57.8（CH2，C-6）.综合分析化合物7的氢谱和碳谱数据，并与文献［15］的数据进行对比，确定一致，故鉴定化合物7为5-羟甲基糠醛.

化合物8为浅棕色油状，正源HRESIMS测得其准分子离子峰m/z=202.086 1［M+Na］+，推出分子式为C10H13NO2（C10H13NO2Na 的分子量理论值为202.083 8）.根据核磁可知该化合物的1H-NMR 数据（acetone-d6，500 MHz）δH分别为：7.03（d，J=8.3 Hz，2H）、6.75（d，J=8.3 Hz，2H）、3.34（m，2H）、2.67（t，J=7.4 Hz，2H）和1.86（s，3H）.13CNMR 数据（acetone-d6，125 MHz）δC分别为：130.52（C，C-1）、130.9（CH，C-2 和C-6）、116.2（CH，C-3和C-5）、157.0（C，C-4）、35.4（CH2，C-7）、42.8（CH2，C-8）、173.8（C，C-9）和22.0（CH3，C-10）.综合分析化合物8 的氢谱和碳谱数据，并与文献［16］的数据进行对比，确定一致，故鉴定化合物为N（-4-羟基苯乙基）-乙酰胺.

化合物9为浅棕色油状，正源HRESIMS测得其准分子离子峰m/z=155.034 0［M+H］+，推出分子式为 C7H6O4（C7H7O4的分子量理论值为 155.033 9）.根据核磁可知该化合物的1H-NMR 数据（DMSO-d6，500 MHz）δH分别为：12.33（s，1H）、9.56（s，2H）、6.79（d，J=2.1 Hz，2H）和6.40（s，1H）.13C-NMR数据（CD3OD，125 MHz）δC分别为：170.3（COOH）、159.6（C，C-1）、109.1（CH，C-2 和 C-6）、159.6（C，C-3 和C-5）、108.1（CH，C-4）和151.0（C，C-6）.综合分析化合物9的氢谱和碳谱数据，并与文献［17］的数据进行对比，确定一致，故鉴定化合物9为3，5-二羟基苯甲酸.

2.2 化合物的体外生物活性评价

利用Con A 诱导脾淋巴细胞增殖，对化合物1～9进行体外免疫抑制活性评价，结果发现，只有化合物5的平均抑制率达到50.9%，其半抑制浓度（IC50）为35.3 μmol/L，表明化合物5 对小鼠脾细胞具有免疫抑制活性，其余化合物在免疫抑制、抗肿瘤和抗老年痴呆活性测试中均显示无活性.

3 结 论

拟茎点霉属（Phomopsis）和曲霉属（Aspergillus）真菌是红树植物内生真菌中常见的种属［18］，为结构新颖的活性化合物的重要来源［19-20］.本研究从两株红树植物内生真菌Phomopsissp. DHS11 和Aspergillus fumigatusJRJ111048的乙酸乙酯提取物中分离纯化得到9种化合物.其中，化合物1～2为苯并呋喃酮类化合物，化合物1为首次发现的新型苯并呋喃酮类化合物，命名为norpestaphthalide C，其骨架结构与文献［8］报道的化合物2（norpestaphthalide A）的结构相似.化合物norpestaphthalide A 于1996 年在海洋沉积物真菌中被发现，它对小鼠tsF210细胞生长具有较好的抑制活性［21］.化合物3 为7-hydroxy-3- (2-hydroxy-propyl) -5-methyl-isochromen-1-one，于1977年从植物病原菌Drechslera siccans中首次分离得到［22］，同时也在地衣内生真菌Ulocladiumsp. 中发现［10］.化合物4 为脑苷脂类化合物alternaroside B，从一株海洋耐盐真菌Alternaria raphani中分离得到，它对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌具有一定程度的抑菌活性［11］.本研究首次从拟茎点霉属真菌Phomopsissp. 中报道该类化合物，进一步丰富了该化合物的来源.化合物5为细胞松弛素B，于1967 年首次从Helminthosporium dematioi-deum中分离鉴定［23］，该化合物对肺癌和腺癌（M109、Lewis lung 和LA4）及B16F10 黑色素瘤具有较好抑制活性，低浓度的细胞松驰素B 还能抑制GlcNACase 分泌［24］.化合物 6 为啤酒甾醇，1985 年首次从自然界中的地中海苔藓虫分离得到［25］.化合物7为5-羟甲基糠醛，于2005年首次从毛茛属Rannunculus ternatus.中分离得到［26］.化合物 8 为 N-（4-羟基苯乙基）-乙酰胺，于1959年从分枝杆菌和肠道细菌的代谢产物中被发现，并于1995 年首次从真菌发酵液中发现，且发现其具有抑制胆固醇合成活性［27］.本研究对化合物1～9 进行了体外抗肿瘤、阿尔兹海默症和免疫抑制活性筛选，结果发现，化合物5 具有较好的免疫抑制活性，其半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50）值为 35.3 μmol/L，阳性对照药物环孢菌素A 的IC50值为4.2 μmol/L.其余化合物均未筛选到抗肿瘤、抗老年痴呆和免疫抑制活性.