三棱提取物抑制糖酵解限速酶抗黑色素瘤机制研究

刘洋,郑秀芹,杨葛俊,赵涵,陆茵,王爱云,陈文星

(1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏 南京 210023)

皮肤恶性黑色素瘤(Cutaneous malignant melanoma,CMM)是一种源于表皮正常黑色素细胞或原有痣细胞的恶性肿瘤,致病原因包括紫外线辐射、遗传因素、外伤刺激、病毒感染、免疫反应等[1]。其恶性程度高,易局部复发和远处转移,一旦发生转移,致死率高,预后极差,近几十年来,黑色素瘤的全球发病率逐年增加且呈年轻化趋势[2]。目前黑色素瘤的主流治疗方法包括放射疗法、药物靶向治疗和免疫疗法等,但往往疗效不佳,存在明显的不良反应和易耐药性[3],因此亟需开发新的治疗手段。

代谢重编程是恶性肿瘤的一个标志[4],表现为在氧气足以支持线粒体氧化磷酸的情况下,肿瘤细胞仍采用糖酵解的方式进行代谢,即Warburg效应。这种低效但快速的代谢方式消耗了肿瘤微环境中大量的葡萄糖,合成了肿瘤快速增殖所需要的前体物质,同时分泌的乳酸形成了免疫抑制微环境[5],因此靶向肿瘤细胞的代谢方式是目前抗肿瘤治疗富有前景的重点策略。

化瘀散结法是中医临床抗肿瘤的重要法则之一[6],中药三棱作为破血化瘀代表药,具有抗血小板聚集、降低全血黏度、镇痛、抗癌等药理作用。目前关于三棱抗肿瘤的报道众多,如三棱水提物能够提高H22肝癌荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2水平,增强免疫力,从而抑制肿瘤生长[7];三棱散水提物对人胃癌SGC-7901细胞有抑制增殖和促凋亡作用[8];三棱总黄酮通过诱导S/G2细胞周期停滞来抑制雌激素受体阳性肿瘤细胞A549、MCF-7的增殖活性[9]。恶性黑色素瘤作为人类皮肤肿瘤中恶性程度最高的一种疾病，治疗和预防黑色素瘤的药物开发是目前研究的热点，三棱中活性成分芒柄花黄素(又名刺芒柄花素)可抑制人黑色素瘤细胞A375的活力并诱导细胞凋亡，其机制与启动Caspase-3介导的凋亡途径相关[10]；三棱成分山柰酚通过作用于Akt/GSK-3β信号通路抑制HK2-VDAC1在线粒体的结合，影响了黑色素瘤细胞A375和B16F10的糖酵解代谢活动，进而抑制了黑色素瘤的转移[11]。这些研究提示了三棱在治疗皮肤恶性黑色素瘤中存在潜在的临床价值。

1 材料与方法

1.1 实验细胞

人源黑色素瘤A375细胞由上海细胞所提供。采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养于37 ℃,5% CO2的恒温培养箱。

1.2 实验仪器

细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific公司,型号:Veriti96);生物安全柜(ESCO公司,型号:ESCO AC2);全自动细胞计数仪(Countstar公司,型号:IC1000);离心机(湘仪公司,型号:L420);倒置显微镜(ZEISS公司,型号:AX10);海马能量代谢实时测定仪(Agilent公司,型号:XF24);酶标仪(BioTek公司,型号:Synergy2)。

1.3 药物与试剂

三棱提取物(SLTQW)冻干粉(南通飞宇生物科技有限公司,批号:FY20S0413,经鉴定本品为棕黄色粉末,过80目筛,干燥失质量≤5.0%)，经HPLC定性检测，鉴定出三棱提取物中含有刺芒柄花素、常春藤皂苷元、豆甾醇、β-谷甾醇等成分;DMEM高糖培养基(江苏凯基生物公司,货号:KGM12800NH-500);胎牛血清(Cellmax公司,货号:SA301.02);青霉素(Biosharp公司,货号:Amresco0242);链霉素(Biofroxx公司,货号:3810-74-0);胰蛋白酶(Amersco公司,货号:3112);CCK-8细胞增殖检测试剂盒(江苏凯基生物公司,货号:KGA317);BeyoClickTMEdU-555细胞增殖检测试剂盒(碧云天公司,货号C0075S);葡萄糖测试盒(货号:F006-1-1)、乳酸测定试剂盒(货号:A019-2-1)、丙酮酸测定试剂盒(货号:A081-1-1)、己糖激酶试剂盒(货号:A077-3)、果糖磷酸激酶活性测定试剂盒(货号:A129-1-1)、丙酮酸激酶测试盒(货号:A076-1-1)购自南京建成公司；PKM2(货号:15822-1-AP)、LDHA(货号:19987-1-AP)、MCT4(货号:22787-1-AP)、β-actin抗体(货号:66009-1-Ig)购自Proteintech公司。

1.4 实验方法

1.4.1 三棱相关靶点筛选 通过TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)寻找中药三棱所含有的化合物,根据ADME属性进行筛选,设定口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%,类药性(Drug likeness,DL)≥0.18,得到三棱有效活性成分。并利用TCMSP数据库获取三棱有效成分的作用靶点,导入Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)进行基因名规范化处理。

1.4.2 三棱-黑色素瘤靶点PPI网络构建 以“melanoma”“cutaneous melanoma”“malignant melanoma”为关键词在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/Guide/GeneCard)中挖掘黑色素瘤的潜在靶点。为了探究靶点蛋白在系统水平上的作用,利用Cytoscape3.7.2软件中的Bisogenet插件,分别构建成分靶点PPI和疾病靶点PPI,对两者进行拓扑分析并筛选核心靶点。

1.4.3 三棱-黑色素瘤靶点功能与通路的富集分析 采用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)对PPI网络中的核心靶点进行KEGG通路富集分析,探究靶点蛋白在信号通路中的作用,得到三棱在黑色素瘤治疗中的主要作用通路,并通过Omicshare软件(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/seniorbubble)对富集结果进行可视化处理。分析所得到的结果,随后设计实验以确定三棱提取物的抗黑色素瘤药效,并根据富集到的通路开展相关实验。

1.4.4 CCK-8法检测三棱提取物对A375细胞活力的影响 取对数生长期的A375细胞,用胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液,以每孔5×103的密度接种于96孔板,置于37 ℃、5% CO2培养箱中过夜,使细胞贴壁。实验设置对照组、空白组以及三棱提取物不同浓度组(0、50、100、200、400、800 μg·mL-1),每组设置6个复孔。置于培养箱中培养24、48 h后,每孔加入10 μL CCK-8试剂,置于培养箱中孵育2 h,用酶标仪于450 nm处测定吸光度A。根据公式计算:细胞存活率=(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。

1.4.5 EdU法检测三棱提取物对A375细胞增殖能力的影响 将A375细胞以每孔2×10密度接种于6孔板,待细胞贴壁后加入不同浓度的三棱提取物(0、200、400 μg·mL-1)培养24 h,吸除培养基,加入终浓度为10 μmol·L-1的EdU工作液,标记完成后进行固定透化处理。每孔加入0.5 mL Click反应液,室温避光孵育30 min,洗涤液洗涤3次后,置于荧光显微镜下观察并统计EdU阳性细胞率。EdU阳性细胞率=EdU染色阳性细胞数/总细胞数目×100%。

婆婆缓和了半天情绪后，对钱海燕说：“燕燕，这段时间你受苦了，妈还老是不理解你。对不起啊。”然后又对周启明说：“儿子，没事的。你不用担心钱，还有我和你爸呢。”那天晚上，一家人哭成一团。

1.4.6 胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)测定 将A375细胞按每孔1×104的密度进行铺板,第2天各孔分别加入相应的药物(对照组与SLTQW 400 μg·mL-1组)干预24 h。Agilent Seahorse XF Cell Mito Test Kit的检测步骤包括:①上机前一天,在XF96 Extracellular Flux Assay Kits下层加入200 μL水化液;放入37 ℃无CO2的培养箱中水化过夜。②配制所需加入的药物和海马XF base medium,并调节pH值至7.4±0.1,在使用时将其放入37 ℃水浴锅水浴1 h。③第2天,用水浴好的海马XF base medium清洗细胞2次,最终每孔加入175 μL海马XF base medium,置于37 ℃无CO2的培养箱培养1 h。④将药物按所需浓度进行稀释,并加入XF96 Extracellular Flux Assay Kits上层中,每个孔加入25 μL,上机。⑤30 min后取出,XF96 Extracellular Flux Assay Kits下层换成已经在37 ℃无CO2的培养箱培养1 h的细胞板,上机检测[12]。

1.4.7 糖酵解相关代谢产物含量检测 将A375细胞以每孔3×105的密度接种于6孔板内,待细胞汇合度长至60%～70%,换液加入含有不同浓度三棱提取物(0、6.25、25、100、400 μg·mL-1)的培养基,在培养箱中培养24 h。待给药24 h后,收集细胞或上清,根据相关试剂盒说明书进行操作,到达反应时间后利用酶标仪检测OD值。同时,提取各组细胞蛋白,测定蛋白浓度,进行归一化处理,以排除细胞数差异的影响。

1.4.8 糖酵解激酶活性检测 铺板及给药操作同1.4.7,给药24 h后,吸去培养基,将细胞用1×PBS清洗3遍,之后每孔加入100 μL提取液,使用细胞刮刀收集细胞至离心管,置于组织研磨仪中进行机械研磨,研磨完成后,12 000 r·min-1离心10 min,取上清按相关试剂盒说明书进行操作,到达反应时间后利用酶标仪检测OD值,根据说明书计算激酶活性,并除以相应的蛋白浓度进行归一化处理。

1.4.9 Western blot 收集不同浓度三棱提取物处理24 h后的A375细胞,加入含PMSF的RIPA裂解液提取蛋白,冰上裂解30 min,收集细胞于离心管中,4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min,加入上样缓冲液,95 ℃金属浴变性10 min。SDS-PAGE电泳后,转至PVDF膜,封闭1 h,加一抗孵育过夜。TBST洗涤4次,每次5 min,加二抗孵育2 h,TBST洗涤后进行ECL化学发光。

2 结果

2.1 三棱有效成分及其可能的作用靶点

利用TCMSP数据库获取中药三棱中所含有的化合物,以ADME属性进行筛选,最终获得5个活性成分(表1),包括常春藤皂苷元(Hederagenin)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、刺芒柄花素(Formononetin)、豆甾醇(Stigmasterol)、反式-11-二十碳烯酸(trans-Gondoic acid),将三棱有效成分的蛋白靶点导入Uniprot数据库中,转化为基因名称,删除重复值,最终得到70个药物作用靶点(图1)。

图1 三棱活性成分潜在靶点图Fig.1 Potential targets map of active ingredients in Sparganii Rhizome

表1 中药三棱主要活性成分Table 1 Main active ingredients in Sparganii Rhizome

2.2 三棱-黑色素瘤靶点PPI网络构建

在GeneCards数据库中以“melanoma”为关键词共检索出6 385个黑色素瘤相关靶点,Score值越高则代表该靶点与疾病联系越密切,在靶点过多的情况下,根据经验,选择卡4次中位数,得到399个与黑色素瘤相关最高的靶点。通过Cytoscape3.7.2软件中的Bisogenet插件,分别构建三棱活性化合物靶点PPI和黑色素瘤靶点PPI。将2个PPI网络相交得到Merge网络图。使用CytoNCA插件对网络中所有点的拓扑参数进行分析,选择度值≥68作为筛选核心靶点的条件,得到605个节点、24 732条边组成的PPI网络,进一步采用中位数法进行筛选,设置DC>109,BC>0.000 789 09,CC>0.472,NC>122.688,LAC>20.882,得到由86个节点、828条边组成的核心PPI网络(图2),涉及到的核心节点包括RPL6、PARP1、KDM1A、HIF1A、MAP3K1等基因,提示三棱可能通过作用于这些蛋白发挥治疗黑色素瘤的作用。

图2 PPI网络核心靶点筛选图Fig.2 Core targets of PPI network

2.3 三棱-黑色素瘤靶点功能与通路的富集分析

将核心PPI网络中的基因输入DAVID平台进行KEGG通路富集分析,选取P<0.05且基因富集度较高的20条信号通路(图3),主要包括代谢相关通路、p53信号通路、AMPK信号通路、MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路、凋亡、HIF-1信号通路、细胞周期、mTOR信号通路,表明三棱中活性成分通过多种途径发挥抗黑色素瘤的作用,随后围绕预测结果中的代谢相关通路设计实验进行验证。

注：与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。图3 KEGG通路富集分析气泡图Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis

2.4 三棱提取物对A375细胞生长的影响

CCK8结果显示,不同浓度的三棱提取物分别作用A375细胞24 h后,给药浓度达到400 μg·mL-1时对细胞的活力产生了显著抑制作用(图4),在给药48h后,三棱提取物浓度在200 μg·mL-1时便显著抑制了细胞的增殖。EdU增殖实验结果显示(图5),与对照组(71.77±3.56)%相比,给药组200、400 μg·mL-1处理A375细胞24 h后,EdU阳性细胞率显著降低,分别为(56.93±7.65)%、(39.23±6.47)%,表明三棱提取物可剂量依赖性抑制A375细胞的增殖。

注：与对照组相比,图4 不同浓度三棱提取物分别在24、48 h对A375细胞活力的影响Fig.4 Effects of different concentrations of Sparganii Rhizome extract on A375 cell viability at 24 h and 48 h

注：与对照组相比,图5 三棱提取物对A375细胞增殖的影响Fig.5 Effect of Sparganii Rhizome extract on proliferation of A375 cells

2.5 三棱提取物对A375细胞能量代谢的影响

利用Seahorse XF仪器,程序性加入糖酵解抑制剂以及线粒体氧化磷酸化抑制剂,实时监测细胞外氢离子浓度,以胞外酸化率(ECAR)表示A375细胞的糖酵解能力,同时测定细胞的氧气消耗速率,以细胞耗氧量(OCR)表示细胞的线粒体呼吸能力。实验结果如图6所示,三棱提取物能够显著降低A375细胞的ECAR,降低了细胞的糖酵解能力和糖酵解储备。同时三棱提取物还降低了A375细胞的OCR,降低了细胞的基础耗氧量和最大耗氧量,影响了其线粒体氧化磷酸化过程。

图6 三棱提取物对A375细胞ECAR、OCR的影响Fig.6 Effect of Sparganii Rhizome extract on ECAR and OCR of A375 cells

2.6 三棱提取物对A375细胞糖酵解代谢产物的影响

肿瘤细胞大量摄入葡萄糖,通过糖酵解途径生成丙酮酸,最终在细胞质内转化为乳酸,过程中伴有ATP的生成。因此,本研究通过试剂盒检测黑色素瘤细胞A375的葡萄糖消耗量以及丙酮酸、乳酸、ATP生成量来考察三棱提取物对黑色素瘤细胞有氧糖酵解的影响。结果如图7所示,三棱提取物剂量依赖性降低了A375细胞的葡萄糖消耗量和丙酮酸、乳酸、ATP的生成,表明给予三棱提取物后,降低了A375细胞的糖酵解活动。

注：与对照组相比,图7 三棱提取物对A375细胞葡萄糖摄取、乳酸、丙酮酸、ATP生成的影响Fig.7 Effects of Sparganii Rhizome extract on glucose uptake, lactic acid, pyruvate and ATP production in A375 cells

2.7 三棱提取物抑制A375细胞糖酵解的内在机制

糖酵解过程中存在3个关键激酶,分别调控着3个不可逆步骤,包括己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK),酶活性检测试剂盒结果表明(图8),不同浓度三棱提取物对A375细胞的HK和PFK活性没有影响,但对PK活性具有显著抑制作用,且呈剂量依赖性。Western blot结果表明(图9),三棱提取物剂量依赖性地抑制了A375细胞中PKM2蛋白表达水平,同时降低了下游乳酸脱氢酶(LDHA)和单羧酸转运蛋白(MCT4)的表达。

注：与对照组相比,图8 三棱提取物对A375细胞糖酵解关键激酶活性的影响Fig.8 Effect of Sparganii Rhizome extract on glycolytic key kinase activity in A375 cells

注：与对照组相比,图9 三棱提取物对A375细胞糖酵解关键激酶表达的影响Fig.9 Effect of Sparganii Rhizome extract on expression of glycolytic key kinases in A375 cells

3 讨论

恶性黑色素瘤在中国传统医学上并无统一称谓,一般归属于“脱痈”“厉痈”“翻花”“黑子”等范畴,中医对于黑色素瘤的认知源远流长,早在两千多年前的《黄帝内经》中就有关于“厉痈”和“脱痈”的记载。中医在治疗黑色素瘤上具有不易产生耐药性、副作用小、个体化靶向治疗等优点,近年来,中药提取物成为中医治疗黑色素瘤的新途径[13]。因此,从数目众多的中药中筛选出符合临床要求的抗黑色素瘤药物具有重要的临床价值。

三棱对黑色素瘤具有潜在的治疗作用,但其主要活性成分和可能的抗癌机制尚不清楚。本研究基于网络药理学方法,获取三棱中5个主要活性化合物,包括常春藤皂苷元、β-谷甾醇、刺芒柄花素、豆甾醇、反式-11-二十碳烯酸,这5种成分可能是三棱发挥治疗黑色素瘤疗效的物质基础。Cheng等[14]研究发现,常春藤皂苷元通过降低乳腺癌细胞线粒体中Apaf-1和Cyto-C蛋白水平,并增加caspase-3和caspase-9的活性,从而诱导肿瘤细胞的凋亡。β-谷甾醇通过干扰多种信号通路,包括细胞周期、凋亡、增殖、侵袭、血管生成、转移和炎症,发挥抗肿瘤作用,且因为其毒副作用较低,在抗癌营养品领域具有较高研究价值[15]。刺芒柄花素通过增加细胞内活性氧(ROS)水平[16]、调节PI3K/Akt/mTOR信号通路[17]、诱导细胞周期停滞[18]等多环节抑制肿瘤发生发展。张硕等[19]发现豆甾醇能够显著上调抑癌基因NF-2及磷酸激酶Map2k6的表达,同时降低fos、myc、ras等癌基因的表达,在体内外对肝细胞均有一定的抑制效果。而反式-11-二十碳烯酸在抗肿瘤方面目前尚无明确的报道,值得进一步研究其潜在的作用机制。

本研究对三棱-黑色素瘤PPI网络的核心靶点进行了KEGG通路富集分析,结果表明,三棱防治黑色素瘤的作用靶点包括RPL6、PARP1、KDM1A、HIF1A、MAP3K1等基因,作用途径涉及糖酵解/糖异生相关代谢通路、p53信号通路、AMPK信号通路、MAPK信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、mTOR信号通路等。同时,现代研究报道,黑色素瘤表现出高糖酵解活性的代谢表型[20],针对这种代谢特点采取相应的治疗手段或许是未来治疗黑色素瘤的重点策略[21]。因此,本研究进一步考察了三棱对黑色素瘤代谢的影响,结果表明,三棱提取物剂量依赖性的减少了A375细胞葡萄糖摄取,降低了糖酵解代谢关键产物丙酮酸、乳酸、ATP的生成量,且对糖酵解过程中的丙酮酸激酶有显著的抑制作用。同时,三棱提取物还抑制了丙酮酸向乳酸的转化及乳酸的外排功能,降低了胞外酸化率,最终抑制了细胞的增殖。

综上所述,本研究运用网络药理学方法获取了中药三棱治疗黑色素瘤的主要活性成分、作用靶点及相关通路,体现了中药多成分、多靶点、多途径的作用特点,并通过体外细胞实验发现了三棱提取物对A375细胞糖酵解代谢的抑制作用,证实了三棱治疗黑色素瘤可能与改变肿瘤细胞的代谢方式有关,为进一步研究破血药三棱在治疗黑色素瘤方面的应用提供了思路和理论依据。