周8425B衍生品种耐旱相关性状的遗传解析

于海飞，王丽娜，殷贵鸿，邹少奎，李楠楠，张 倩，吕永军，王雅美，韩玉林

(1.周口市农业科学院，河南周口 466000；2.中山大学农学院，广东广州 510275)

水资源短缺已成为威胁中国粮食生产安全的重要因素之一[1]。全球拥有近15亿hm2耕地，近60%的粮食产量需要在灌溉条件较差的旱地产出[2]。近年来，随着全球气候变化加剧，干旱程度愈发严重，干旱周期加速，对全球粮食生产的威胁增大。小麦是中国重要的粮食作物之一，是中国北方人民的主食作物，受干旱胁迫影响极大。小麦全生育期需水量较大且生长季节降水量较少。近年来，由于气候剧烈变化，中国小麦主产区地下水位大幅下降，严重威胁小麦生产安全[3]。发掘耐旱相关基因，培育耐旱品种，是保证小麦生产安全最为经济、高效的途径。

耐旱相关性状是由多基因控制的复杂数量性状，易受外界环境条件影响，遗传机制复杂。基于基因型和表型的连锁分析和关联分析是挖掘数量性状基因位点的两种主要方式[4-6]。传统的连锁分析一般以双亲遗传群体为材料，结果较为可靠，但需大量的人力和物力资源，且所有遗传变异来源于双亲，无法反映出自然界广泛存在的遗传变异。全基因组关联分析(genome-wide association analysis，GWAS)则可有效弥补连锁分析的缺陷，其基于自然群体，可反映自然界广泛存在的遗传变异，且无需构建群体，有效降低人力和物力消耗，缩短研究时间。然而，GWAS一般需要密度较高且覆盖度较广的基因型数据。近年来，SNP芯片技术渐渐成为分子标记检测的主流技术，并在水稻(44K)、玉米(50K和55K)及小麦(9K、90K、660K、15K和50K)等重要作物中广泛应用[7-9]。基于SNP的GWAS已广泛应用于小麦加工品质[10]、生理性状[11]、抗病抗逆性[2,5-7]以及产量[5-6]等相关性状基因的发掘研究。

黄淮麦区是中国重要的小麦产区，可提供全国近70%的小麦产量[12]。近年来，由于在育种工作中过于追求高产，黄淮麦区小麦品种多在高水肥条件下选育而成，生产上缺乏在干旱条件下耐旱性好、减产少且在水分充足条件下高产、不倒伏的水旱兼用型品种[3]。周8425B是黄淮麦区重要的骨干亲本，具有优异的农艺性状和较强的耐旱能力[13]，目前利用周8425B已育成100多个衍生品种(系)，且其后代具有较好的耐旱性。分析周8425B及其衍生品种的耐旱性，发掘其耐旱位点，开发相关的分子标记，可为黄淮麦区水旱兼用型品种分子辅助育种提供指导。本研究将周8425B及其68个衍生系品种连续2年2点种植，利用小麦50K SNP芯片对耐旱相关性状进行GWAS分析，以期发掘耐旱相关性状的基因位点，为耐旱品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为周8425B及其68份衍生品种，详细信息见表1。

表1 供试品种名称及其系谱信息

1.2 田间试验和表型调查

周8425B及其衍生群体分别于2015-2016和2016-2017年度种植于周口市农业科学院试验基地和郑州荥阳试验基地。周口试验基地地下水埋深7 m以上，2015-2016和2016-2017年度份小麦生长季有效降雨量分别为238.7和256.4 mm；郑州试验基地下水埋深7 m以上，2015-2016和2016-2017年度小麦生长季有效降雨量为204.6和216.3 mm。为开展耐旱表型测定，试验开展期间全生育期不人工灌水。采用完全随机区组设计，3次重复。单个小区面积6 m2，行距20 cm，小区间距40 cm。肥料施用及病虫害防治等田间管理措施同大田生产。

性状调查主要包括苗期胚芽鞘长度、旗叶叶绿素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量和耐旱指数[14-15]。调查方式如下：(1)苗期胚芽鞘长度：播种后第3 d开始，连续6 d于小区内长势均匀区域测定30株幼苗的胚芽鞘长，取平均值作为该品种的胚芽鞘长度；(2)旗叶叶绿素含量：于花后7 和14 d，用手持式SPAD仪在每个小区内随机选取10片旗叶测定旗叶叶绿素含量，取平均值作为该品种的叶绿素含量；(3)旗叶脯氨酸和可溶性含量：于花后7和14 d，于小区内随机选取3片旗叶，利用液氮冷冻磨碎后称取0.5 g放入试管中，利用酸性茚三酮法测定叶片内脯氨酸含量，利用蒽酮比色法测定叶片可溶性糖含量。(4)耐旱指数：耐旱指数=(旱地产量/正常灌溉产量)×(旱地产量/对照品种旱地产量的平均值)。

1.3 表型统计分析

利用Microsoft Excel 2019进行基本统计量分析；利用SAS V9.4进行性状间表型相关分析、方差分析(Analysis of variance，ANOVA)和最佳线性无偏估计值(Best linear unbiased prediction，BLUP)值的计算。

1.4 SNP基因分型和群体结构分析

每个样品选取5个材料的幼嫩叶片，混合取样，采用CTAB法提取植株基因组DNA。由北京博奥晶典生物技术有限公司进行50K SNP芯片检测，用GenomeStudio polyploid clustering v1.0软件进行基因型分型。SNP质控标准为最小等位基因频率(minor allele frequency,MAF)>5%且缺失率<20%[16]。经过滤后，共计36 686个SNP标记用于构建物理图谱(未发表)。21条染色体平均标记密度为0.38 Mb，A、B和D染色体组平均标记密度分别为0.43、0.38和0.34 Mb。

选取2 000个在染色体上均匀分布的过滤后的SNP标记。用Admixture 1.3.0(http://dalexander.github.io/admixture/download.html)进行群体结构分析；用Tassel v5.0构建Neighbor-Jointing进化树和进行主成分分析；用Tassel v5.0软件中的Kinship模块，采用Scaled_IBS方法计算亲缘关系矩阵；用Tassel v5.0中的全矩阵(full matrix)和滑动窗口(sliding window)进行LD衰减分析，以第95百分位的r2值与LD衰减曲线的交叉点作为LD衰减距离。基于全基因组LD衰减距离，以8 Mb间隔来区别不同位点。

1.5 全基因组关联分析

用Tassel v5.0软件的混合线性模型(MLM，PCA+K)对耐旱相关性状进行GWAS。以P≤0.001作为该标记与性状显著关联阈值，R2表示解释表型效应百分率。GWAS分析的QQ图(quantile-quantile plot)和曼哈顿图(manhattan plot)由R语言CMplot程序包(https://cran.r-project.org/web/packages/CMplot/)绘制。

2 结果与分析

2.1 耐旱相关性状的表型

从表2可以看出，不同品种的胚芽鞘长度、耐旱指数以及旗叶可溶性糖、脯氨酸和叶绿素含量(花后7和14 d)均不同，且各性状变化范围较大。方差分析结果(表3)表明，基因型、环境及基因型与环境互作对周8425B衍生品种的胚芽鞘长度以及旗叶可溶性糖和脯氨酸含量(花后7 d和14 d)影响显著，其中环境对胚芽鞘长度的影响最大。

表2 耐旱相关性状的最佳线性无偏估计值

表3 耐旱相关性状的方差分析(F值)

2.2 耐旱相关性状GWAS分析

利用Tassel v5.0的MLM模型对耐旱相关性状进行GWAS分析，结果表明，共检测到252个显著性SNP标记，分布于37个位点上(表4和图1)。其中，检测到29个与胚芽鞘长度显著关联的SNP标记，分布在3B、4B、5A、5D(2)和7D染色体上的6个位点内，可解释8.8%～14.1%的表型变异。检测到7个与花后7d旗叶脯氨酸含量显著关联的SNP标记，分布在1A、1B、5A和6D染色体的4个位点上，可解释9.4%～15.8%的表型变异。检测到5个与花后14 d脯氨酸含量旗叶显著关联的SNP标记，分布在2A、6D和7A染色体的3个位点上，可解释8.7%～10.8%的表型变异。另外，检测到32个与花后7 d旗叶叶绿素含量显著关联的SNP标记，分布在2B、5A和7D染色体的3个位点上，可解释11.7%～13.1%的表型变异。检测到30个与花后14 d旗叶叶绿素含量显著关联的SNP标记，分布在3A、6A(2)、6D和7B染色体的5个位点上，可解释10.5%～13.1%的表型变异。检测到124个与花后7 d旗叶可溶性糖含量显著关联的SNP标记，分布在1A、2D、3B、3D、4B、7A和7D(2)染色体的8个位点上，可解释11.2%～18.8%的表型变异。检测到20个与花后14 d旗叶可溶性糖含量显著关联的SNP标记，分布在3A(2)、3D和7D染色体的4个位点上，可解释11.8%～13.8%的表型变异。检测到5个与耐旱指数显著关联的SNP标记，分布在2D、3A和4A染色体的3个位点上，可解释10.3%～12.5%的表型变异。

表4 耐旱相关性状显著相关的位点

图1 耐旱相关性状GWAS分析的曼哈顿图

3 讨 论

胚芽鞘的长度对幼苗耐旱性至关重要。Rebetzke等[17]研究报道，Rht1可调节胚芽鞘长度，可解释27%～45%的表型变异，并在4BL染色体上定位到1个主效QTL，可解释15%～27%的表型变异，与本研究在4B染色体上检测到的AX_109316633距离较近，可能为相同位点。Zhang等[18]分别在3B和5D染色体上检测到与胚芽鞘长度相关的位点，基于物理图谱和多标记公共图谱比较，发现这两个位点与本研究在3B(AX_94421831)和5D(AX_110637256)染色体上检测的位点位置接近，可能是同一个位点。Li等[19]在1BS、2DS、4BS和5BL上检测到4个与胚芽鞘长度相关的位点，但这些位点均与本研究检测到的位点位置不同。推测本研究在5A(AX_95659260)、5D(AX_109714016)和7D(AX_109147840)染色体上检测到的3个位点可能是新的胚芽鞘长度相关位点。

植株可溶性糖含量是耐旱性强弱的重要指标。Galiba等[20]利用中国春染色体代换系在5A染色体上发掘到一个控制可溶性糖含量的位点，与本研究检测到的位点位置均不同。Rebetzke等[21]利用3个RIL群体对茎秆可溶性糖含量进行QTL定位，在1A、1B、2B、2D、4B、7A和7B染色体上检测到多个QTL，基于物理图谱和多标记公共图谱比较，发现与本研究在1A(AX_111561001)、2D(AX_110089653)和7A(AX_110576624)染色体上检测到的位点位置接近或一致。Salem等[22]利用含有114个株系的RIL群体对可溶性糖含量(花后14 d)进行QTL定位，在2D、5D和7D染色体上定位到3个QTL，可解释表型变异的21.0%～42.2%，其中7D染色体上的位点与本研究检测到的AX_111496932位点位置接近。Yang等[23]利用一个含有150个株系的DH群体对茎秆可溶性糖含量进行QTL定位，发现位于3A和3B染色体上的位点与本研究在3A(AX_110454039)和3B(AX_109294391)染色体上检测到的位点位置接近。Zhang等[18]利用262个品种和209个SSR标记对小麦植株、叶片和茎秆可溶性糖含量及用于呼吸和运转的可溶性糖含量进行GWAS，分别检测到13、13、23和14个显著位点，与本研究检测到的位点位置均不同。Dong等[10]利用豆麦/石4185群体将茎秆可溶性糖含量基因TaSST-D1定位在7DS染色体上，可解释8.8%～11.3%的表型变异，与本研究在7D染色体上检测到的AX_110575353位点位置接近。此外，Dong等[10]还利用166份黄淮麦区小麦品种进行90 K SNP检测并开展茎秆可溶性糖含量关联分析，检测到52个显著关联标记，位于23个位点上。其中，11个标记在2个或以上环境中被检测到，这些位点与本研究所检测到的位点位置均不同。综上，3D(AX_110123800)、4B(AX_108778380)、7D(AX_94958668)、3A(AX_111470358)和3D(AX_111922285)这5个位点均可能为新的可溶性糖含量相关位点。

迄今为止，脯氨酸含量依然是较为复杂的表型性状，遗传机制尚不明晰，对旗叶脯氨酸含量进行QTL定位的报道较少。杨 凯等[24]利用中国春-Hope代换系和中国春-长穗偃麦草代换系，认为在4B、5A和5D染色体上可能有控制干旱胁迫下脯氨酸累积的基因存在，在6B和6D染色体上可能有抑制脯氨酸积累的基因存在。此外，Sayed等[25]利用大麦BC2DH群体进行干旱胁迫处理，对脯氨酸含量进行QTL定位，在3H、4H、5H和6H染色体上定位到4个QTL，可解释4.0%～6.1%的表型变异。本研究检测到的脯氨酸含量位点，除5A染色体上的AX_94530985位点与杨 凯等[24]等检测到的位点位置接近外，其他位点均可能为新的位点。

叶绿素是叶片进行光合作用最重要的色素，可直接反映品种在不同时期和干旱胁迫下的耐旱能力。对旗叶叶绿素含量进行基因定位已有大量报道。Zhang等[26]利用小麦DH群体，共检测到17个与旗叶叶绿素含量相关的QTL，其中10个位点在2个或以上环境中被检测到，位于3A和7B染色体的位点分别与本研究检测到的3A(AX_110483079)和7B(AX_109461447)位点位置接近。Sukumaran等[27]在两种灌溉条件下进行产量和生理性状的关联分析，在3B(Kukri_c48750_1372)和6A(wsnp_Ex_c11348_18326787)染色体上检测到2个与灌浆期旗叶叶绿素含量显著相关的位点，其中6A染色体上的位点与本研究在6A染色体上检测到的AX_109981766位点位置接近。Gao等[28]利用90K SNP芯片对含有246个株系的RIL群体的产量及生理性状进行QTL定位，检测到10个与开花期旗叶叶绿素含量相关的QTL，检测到8个与花后10 d旗叶叶绿素含量相关的QTL，其中5AL染色体上的位点与本研究检测到的AX_109860622位点位置接近，可能为同一位点。Shi等[29]、Xu等[30]和Bhusal等[31]分别检测到28、2和17个与旗叶叶绿素含量相关的位点，经比对发现，这些位点与本研究检测到的位点位置均不同。综上，2B(AX_110906386)、7D(AX_109240909)、6A(AX_108754874)和6D(AX_110827708)这4个位点可能为新的叶绿色含量相关位点。

前人对耐旱指数遗传机制也有研究。Kirigwi等[32]在不同灌溉条件下对耐旱指数进行QTL定位，检测到3个耐旱指数QTL，与本研究在4A染色体上检测到的AX_110441266位点位置接近。Kadam等[33]在4BS染色体上定位到一个主效耐旱指数QTL。Shukla等[34]利用包含206个株系的RIL群体并结合173个SSR标记，在3B(2)和4A染色体上检测到3个耐旱指数QTL，可解释12.7%～15.6%的表型变异。其中，4A染色体上的主效QTL在绝大多数环境下均可被检测到，以上检测位点与本研究所检测到的耐旱指数相关位点位置均不同，推测本研究在2D和3A染色体上检测到的3个位点均可能为新的耐旱指数相关位点。

小麦耐旱遗传机制十分复杂。研究品种间耐旱特性差异，筛选耐旱品种，对培育新的优良品种具有重要价值。本研究在68份周8425B衍生系品种中检测到37个与耐旱显著关联的位点。其中，16个位点与前人发现的耐旱相关位点位置部分重叠或一致，这些位点更为可靠，可进一步转化为KASP或STARP标记，用于分子辅助育种和QTL精细定位。21个新的遗传位点可进一步验证其可靠性，并开展后续遗传研究。在周8425B衍生品种中，周麦16、矮抗58、郑农21、淮麦28、周麦21、郑麦379、浏虎98和偃展4110共8份品种具有较好的耐旱性，且含有较多优异等位基因，可作为亲本用以提升育种材料的耐旱性。基于以上结果，下一步研究工作将主要集中于关联位点的验证以及可用SNP标记的开发，为提升小麦品种耐旱性提供参考。