绿肥油菜种质筛选与评价

2022-05-20王晓丹官春云

核农学报 2022年6期

王晓丹马花官梅官春云

(湖南农业大学农学院/国家油料改良中心湖南分中心，湖南长沙 410000)

20世纪中后期以来，我国化肥工业快速发展，促使我国粮食产量不断增加[1]。然而化肥的大量施用造成了江河湖泊水域富营养化[2]，土壤板结、有机碳含量下降，农田氮素迁移[3]，臭氧层破坏，自然灾害频发[4]等一系列问题，使可持续发展面临巨大的压力和挑战[5]。作为一种绿色防控技术，种植绿肥可减少我国化肥农药使用量[6]。因此培育优质绿肥品种，发展绿肥产业对保护生态环境及农业绿色可持续发展具有重要意义。

绿肥油菜作为近年来迅速兴起的有机肥，其种植区域分布广泛，适应性强[7]，且油菜干物质积累量大，翻压可提高土壤养分含量、增强土壤肥力、改善土壤物理性状[8-9]。研究表明，油菜种植可改善细菌群落多样性，增加土壤有益菌群落数量[10]。油菜的碳氮比适中，较紫云英更有利于被土壤微生物分解，养分易被下茬作物吸收[6,11]；油菜中硫苷水解物可抑制杂草[12]、土壤病原菌[13]及土壤线虫[14]等，是区别于其他绿肥作物的重要特征之一。同时，绿肥油菜可结合不同的农作制度需求，如长江流域游的“稻-稻-油”[15]、“莲-油”轮作[16]等，具有独特的应用价值和广阔发展前景。

养分特性是衡量绿肥作物优劣的重要指标，也是决定绿肥对土壤和后茬作物影响大小的重要基础[17]。研究表明，同一生态区不同绿肥作物的养分特性及绿肥作物对土壤理化性质与微生物的影响差异明显[18]。本研究以两个绿肥油菜品种油肥1号[19]、油肥2号[20]为对照，检测12个油菜品系植株养分含量、土壤养分含量及土壤微生物类群，比较品种间差异，以期筛选出优质绿肥种质资源，促进绿肥油菜育种。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地点位于湖南省长沙市湖南农业大学耘园基地(113°07′E、28°18′N)，属亚热带季风湿润气候，年平均气温17.2℃，年积温为5 457℃，年均降水量 1 361.6 mm。试验田施行“稻-油”轮作，土壤pH值为5.6，有机质、全氮、全磷、速效钾、速效磷的含量分别23.80、1.40、0.70、0.28、0.01 g·kg-1。

1.2 试验设计

试验采用田间随机区组设计，油肥1号、油肥2号和12个油菜品种(系)见表1。小区面积为2×4 m2，种植密度为15万株·hm-2，每个品系设3次重复，共42个小区。于2018年9月27日播种，条播，田间管理按大田油菜栽培方法进行。

表1 供试油菜品种(系)Table 1 List of tested oilseed rape varieties (lines)

1.3 试验方法

在作物苗期、盛花期分别进行植株和土壤取样，参照王营营[21]的方法测定植株指标(全氮、全磷、全钾含量)与土壤养分指标(全氮、速效钾含量)。土壤样品委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司，基于IonS5TMXL测序平台，利用单端测序(Single-End)的方法进行16S(V3+V4)区域扩增子测序。

1.4 数据分析

采用SPSS 24.0软件进行相关性与主成分分析，并用Origin 2019软件作图，差异显著性检验采用LSD法，P<0.05时认为差异达到显著水平。高通量数据的生物信息学分析通过诺和云平台进行。

2 结果与分析

2.1 植株养分特性差异

14个油菜品种(系)的氮(N)、磷(P)、钾(K)含量测定结果见表2，相比对照，多数品系苗期养分含量差异显著。在氮含量方面，品系编号为4、10、12、11、9、7的植株苗期全氮含量均高于CK1和CK2；在磷含量方面，除品系5外，其他品系的苗期全磷含量均高于CK1和CK2，其中品系6全磷含量显著高于其他品系(P<0.05)；在钾含量方面，品系10、9、4、12苗期全钾含量显著高于CK1和CK2。相比对照，多数品系盛花期养分含量存在显著差异。在氮含量方面，品系11、13、4、8、5植株盛花期全氮含量均高于CK2；品系8植株盛花期全磷含量最高，除品系7和1外，其他参试品系均高于CK1；品系1和9盛花期全钾含量高于CK1和CK2，其中品系1显著高于其他品种(系)(P<0.05)。总体而言，品系4和11植株养分含量较高。

14个油菜品种(系)氮(N)、磷(P)、钾(K)单株积累量测定结果表明(表2)，苗期品系5植株的氮、磷、钾积累量均显著高于其他品种(系)(P<0.05)；盛花期时，品系11、4、10、8、2、3、12、5的全氮单株积累量高于CK1和CK2，品系11号显著高于其他品种(系)(P<0.05)，品系8、10、11、3、2、4、5的全磷单株积累量较高，品系8高于其他品种(系)(P<0.05)，品系11、4、2、1、3、9的全钾单株积累量高于CK1和CK2，品系11号显著高于其他品种(系)(P<0.05)。结合植株养分含量分析表明，油菜养分含量苗期普遍比盛花期高，平均养分积累量则是苗期普遍低于盛花期。以盛花期养分积累量作为筛选指标，品系4、11、3、5表现较优。

表2 不同品种(系)植株养分含量与养分积累量差异Table 2 Nutrient contents and nutrient accumulation of per plant in different varieties

表3 不同品种(系)土壤养分含量差异Table 3 difference of soil nutrient content among different varieties (lines)

2.2 不同生育期/不同品种(系)间土壤养分及微生物特性

2.2.1 不同生育期/不同品种(系)间土壤养分含量差异 14个油菜品种(系)的土壤养分含量测定结果表明(表3)，在苗期，品系11土壤氮含量，品系3、10、4、1、2、9土壤速效磷含量，品系4、11、6、1土壤速效钾含量分别高于CK1和CK2中土壤氮、速效磷、速效钾含量，其中品系4土壤中速效钾含量显著高于两对照(P<0.05)。盛花期，品系10、12、5土壤全氮含量较高，与CK1差异显著(P<0.05)；品系12、2、1土壤速效磷含量显著高于CK1和CK2(P<0.05)；品系11、6、9、10、4、5土壤速效钾含量较高，且品系11显著高于CK1和CK2(P<0.05)。多数品系土壤氮含量在苗期和盛花期以及品种(系)间无显著差异，不同品种(系)土壤全氮、速效磷和速效钾含量在苗期和盛花期的变化情况不一致，整体而言，品系10、11土壤养分含量较高。

2.2.2 不同生育期/不同品种(系)间土壤微生物差异对14个品种(系)苗期与盛花期土壤样本进行16S测序，质控后按照97%相似性进行操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)聚类分析(图1-A、B)，结果显示苗期共享OTU数为1 658，占OTU总数的43.96%，花期共享OTU数为1 480，占OTU总数的40.29%，表明各品种(系)的种群具有一定差异。根据SILVA数据库(https://www.arb-silva.de/)注释结果，苗期各品种(系)土壤细菌在门(Phylum)水平上丰度排名前10的物种(图1-C)分别为变形杆菌(Proteobacteria)、酸杆菌(Acidobacteria)、放线菌(Actinobacteria)、绿弯菌(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌(Firmicutes)、芽单胞菌(Gemmatimonadetes)、疣微菌(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌(Nitrospirae)、蓝细菌(Cyanobacteria)，盛花期其中八类与苗期一致，另外两类为奇古菌(Thaumarchaeota)与未知门类微生物(图1-D)。总体而言，同一时期微生物门水平的组成无明显差异，不同时期微生物门水平的组成差异不大，但绿肥的不同品种(系)和种植的不同时期会影响不同门类微生物的相对含量。

2.3 油菜植株与土壤养分性质以及土壤微生物相关性分析与主成分分析

2.3.1 油菜植株与土壤养分性质以及土壤微生物相关性分析植株养分、土壤微生物和土壤养分间相关性分析结果表明(表4)，在苗期和盛花期，植株养分含

注：A、B分别为苗期(M)、花期(H)不同品种(系)微生物群落种类Venn图； C、D分别为苗期、花期不同品种(系)在门水平的差异。Note: A and B are microbial community types of varieties (lines) at seedling stage and flowering stage respectively(Venn graph). C and D are the differences of varieties (lines) at seedling stage and flowering stage respectively(at the phylum level).图1 不同生育期/不同品种(系)间土壤微生物差异Fig.1 Differences of soil microorganisms in different growth stages/varieties (lines)

表4 油菜植株养分和主要微生物类群与土壤养分性质的相关系数Table 4 Correlation coefficients of plant nutrients and main microbial groups with soil nutrient properties

量与土壤养分含量均无显著相关性，单株氮含量与土壤全氮含量分别存在极显著和显著正相关，同时，盛花期单株磷含量与土壤磷含量之间呈显著正相关。苗期与盛花期的部分微生物类群与土壤全氮、速效磷、速效钾养分含量之间呈现正或负相关性，尤其是厚壁菌门与疣微菌门，在苗期与盛花期与土壤全氮含量均有显著负相关性。由此可知，植株单株养分含量与土壤微生物是影响土壤养分含量的重要因素。

2.3.2 油菜植株与土壤养分性质以及土壤微生物主成分分析据2.3.1分析，植株单株养分积累量与部分微生物类群有正或负相关性，将各品种(系)植株单株养分含量和土壤养分含量及土壤厚壁菌和疣微菌类群标准化后进行主成分分析。表5列出了前5个主成分，可代表14个油菜品种(系)82.87%的养分信息。第一主成分的贡献最大，达28.85%，苗期土壤N含量及植株养分积累量，占较大正向负荷；第二主成分占20.12%，盛花期养分积累量占较大正向负荷；第三主成分中土壤速效钾含量占较大正向负荷；第四、第五主成分占较大正向负荷的是土壤微生物含量。总体来看，第一、第二主成分为植株养分特性因子，第三、四、五因素主要为土壤养分与微生物因子，其中植株养分积累量是绿肥油菜种质资源养分特性评价的主导因子。

将各品种(系)植株和土壤养分特性标准化数值与前5个主成分的特征向量相乘，并加权得到各主成分得分及排名(表6)。与两对照品种相比，在植株养分特性方面，以品系11、4、10、2表现较优，在土壤养分及微生物特性方面，以品系11、6、4、1较优，整体分析来看，品系11、4优于CK1和CK2。

3 讨论

绿肥养分特性对土壤理化性质和后茬作物生长具有重要意义。本研究中苗期和盛花期油菜植株养分含量及单株积累量分析结果表明，盛花期N、P、K含量均低于苗期，与盛花期植株部分养分由茎叶向生殖器官转移有关[22]。而盛花期单株养分积累量高于苗期，表明在油菜营养生长过程中，单株鲜草产量不断增加，进而使单株养分含量不断积累，这与王佳锐[23]的研究结果一致。对于翻压绿肥，翻压养分总量即养分累积量比植株养分含量更为重要，且油菜在盛花期进行翻压可提供更多植株养分，以盛花期养分积累量作为筛选指标，则品系4、11、3、5表现较优。另一方面，尽管苗期植株单株积累量略低，但苗期营养生长旺、茎叶产量较高，栽培时间短，在翻压后易腐熟，以苗期养分积累量作为筛选指标，则品系5、11、8表现较优。

表5 植株和土壤养分特性的主成分分析Table 5 Principal component analysis of plant and soil nutrient characteristics

表6 基于主成分分析的绿肥油菜植株和土壤养分与微生物特性的综合比较Table 6 Comprehensive comparison of nutrient characteristics via principal component analysis

油菜在不同生育期对土壤养分的吸收和利用率不同[24]，不同品种生长情况亦对土壤养分有影响。研究表明，油菜对氮素的吸收量在抽薹前、抽薹至终花、角果发育期分别约占45%、45%、10%[25]，同时氮肥利用率低在油菜生产中亦普遍存在[26]。本研究中，植株氮含量在苗期和盛花期均较高，而相应的土壤氮含量在苗期和盛花期以及品种(系)间均变化差异较小，表明油菜植株需氮量较大，但氮吸收率较低。尽管如此，油菜所吸收的80%以上养分能够以各种形式还田[25]。肖小军等[27]研究表明，在油菜秸秆还田条件下，仅需少量N肥即可满足后茬水稻生长需求。另一方面，油菜根系可分泌多种有机酸和酶类物质，尤其是酸性磷酸酶的分泌，活化释放土壤中难溶态磷，从而提高根际土中速效磷的含量[28-29]，本试验中土壤苗期速效磷的含量低于盛花期，可能与盛花期根系发达，释放了更多难溶态磷有关。整体而言，不同品种(系)氮磷钾含量在苗期和盛花期的变化情况不一致，推测与不同品种(系)的生长发育差异性有关。以土壤养分为筛选指标，则品系11、10、4表现较佳。

不同生育期土壤微生物组成类群不同，不同品系间同一类群占比不同。本研究中，苗期与盛花期微生物丰度及微生物类群存在一定差异，且同一微生物类群在不同品系间含量亦有一定差异。同时，相关性分析表明厚壁菌和疣微菌门类群在苗期与盛花期与土壤养分有显著或极显著相关性。疣微菌门是一门被划分出不久的细菌类群，只有少数被识别的种类，Aguirre-von-Wobeser等[30]研究表明，与对照土壤相比，疣微菌门是唯一一个在玉米(ZeamaysL.)根部土壤中的丰度显着增加的门类，尽管其功能研究尚不明确，但在水稻(OryzasativaL.)[31]、韭菜(Alliumporrum)[32]、甘蔗(Saccharumofficinarum)[33]中已经被证明该类菌可利用植物性碳源促进生长。且疣状菌可以被描述为寡养型，当氮过量时，其丰度降低[34-35]。据此可调控土壤施肥量，避免因施肥量过多而造成的浪费与负面环境影响。厚壁菌是最常见的植物根际细菌之一[36]。据报道，厚壁菌门可培养性很高，在可培养的细菌种类中占14%[37]。Polyanskaya等[38]从豌豆(Pisumsativum)根际分离到一株厚壁菌门的梭状芽胞杆菌(Clostridiumsp.)，对大麦(Hordeumvulgare)和黄瓜(Cucumissativus)的生长均有促进作用，且能抑制番茄(Lycopersicumesculentum)根系有害菌的生长[39]，并提高芒草(Miscanthussinensis)对盐胁迫的耐受性[40]。此外，厚壁菌参与细胞壁生物合成和跨膜转运等[41]，且具有磷酸盐增溶和固氮等多种促进植物生长的特性[42]，以疣微菌和厚壁菌丰度作为筛选绿肥油菜的评价因子进一步研究，对于发展可持续农业具有重要意义。