基于UPLC同时测定三种小麦赤霉病毒素方法的构建与应用

陈 璨，彭 逸，余宁静，卢 杰，司红起，马传喜

(安徽农业大学农学院/农业部黄淮南部小麦生物学与遗传育种重点实验室，安徽合肥 230036)

小麦是全世界广泛种植的粮食作物，我国以小麦为主食的人口约40%，小麦及其制品的质量安全对国民经济和人民生活保障具有重要意义。小麦赤霉病是由禾谷镰孢()、串珠镰孢()和黄色镰孢()等多种镰刀菌引起的真菌性病害；近五年来，我国年均发病面积超7 800万亩，占小麦种植总面积的1/5；在长江中下游、江淮流域、黄淮南部等地经常流行为害，并逐步北移。小麦扬花期如遇连阴雨极易爆发赤霉病，通常导致小麦减产10%～20%，严重发生时小麦减产80%～90%甚至绝收。籽粒受致病菌侵染会累积镰刀菌毒素(mycotoxins)，影响其商品性。因其危害的严重性和防控的艰巨性，2020年被国家农业农村部列入《一类农作物病虫害名录》。

与其他麦类病害相比，小麦赤霉病毒素在籽粒中的积累严重威胁食品安全和人畜健康，当毒素累积量达到一定程度时，其商品性丧失。真菌毒素可以在粮食的生产、加工、储存等环节产生，将真菌杀死可以阻止毒素的产生，但不能消除已经存在的毒素，其进入食物链，富集到一定量就会威胁人畜健康。据世界粮农组织(FAO)估算，全球每年约有1/4的农产品受到真菌毒素的污染，我国小麦及其制品中的毒素污染问题十分严峻。小麦赤霉病产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、雪腐镰刀菌烯醇(nivalenol, NIV)、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)三种镰孢菌毒素广泛污染小麦及相关制品。DON毒素又称呕吐毒素，是小麦中污染率最高的一种倍半萜烯类化合物，人食用后产生厌食、呕吐、腹泻、免疫力低下和反应迟钝等急性中毒症状，可引发食道癌、IgA肾病等。我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》(GB2761-2017)标准中规定了小麦谷物及其制品DON的允许限量≤1 000 μg·kg。NIV毒素是B型单端孢霉烯族化合物类真菌毒素，其毒性是DON的十倍，急性毒性强，人类临床症状主要表现为神经状况异常、吞咽困难、呕吐等；其慢性毒性导致动物生长障碍。我国尚未出台食品中NIV的限量标准，FAO提出的NIV每日限量小于0.70 μg·kg。ZEN毒素是2，4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，对人畜造成急慢性毒性、生殖发育毒性、免疫毒性、细胞毒性等多种毒害作用。我国食品真菌毒素限量标准(GB 13078.2-2006)中规定，谷物及其制品ZEN毒素限量为60 μg·kg，饲料中ZEN允许量低于500 μg·kg。

粮食中真菌毒素的检测方法主要有酶联免疫(ELISEA)、气相色谱及气质联用法(GC/GC-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)等。ELISEA和HPLC法均便于操作、经济高效，但是无法同时测定多种毒素。小麦中镰刀菌毒素往往多种同时存在，由于DON和NIV均属于单端孢霉烯族类，常常被同时测定，吴振兴等采用免疫亲和柱-HPLC同时检测DON和NIV，两种毒素检出限(LOD)皆为100 μg·kg；隋 凯等利用多功能净化柱MFC-HPLC同时检测小麦中DON和NIV，LOD分别为120 μg·kg和160 μg·kg；梁 坤采用MFC-HPLC-二极管阵列检测器(DAD)同时检测DON和NIV，LOD皆为20 μg·kg。而同时检测DON、NIV和ZEN三种毒素的方法未见报道。GC/GC-MS法需要待测物具有易挥发、热稳定性等特点，操作较复杂，逐渐被液相色谱法所取代。液相色谱法中，超高效液相色谱(UPLC)的速度、灵敏度和分离度优于高效液相色谱(HPLC)；在同时测定多种毒素方面，液相色谱-质谱兼具高分离效率和高灵敏度，但仪器昂贵，使用成本较高。本研究拟建立MFC-UPLC-DAD法同时测定小麦面粉中DON、NIV和ZEN，并与MFC-HPLC-DAD法的测定结果进行比较，为小麦真菌毒素的检测和抗赤霉病品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料收集自赤霉病多发的长江中下游麦区、黄淮冬麦区南片和赤霉病新发的北方冬麦区、西南麦区，具有赤霉病抗性差异的品种129份，包括安农8455、安农1589、扬麦158、苏麦3号、生选3号、扬麦14、内麦836、小偃6号、望水白9个不同抗性代表小麦品种。于2019年10月播种于安徽省合肥市庐江安徽农业大学皖中试验站小麦赤霉病自然发病鉴定区。随机区组设计，每个品种种植3行，行长2 m，行距20 cm，田间管理同大田，不防病。材料于2020年5月进行收获并脱粒，脱粒后的小麦籽粒烘干暴晒后干燥密封室温贮藏，用于毒素测定。

1.2 MFC-UPLC-DAD(以下简称UPLC法)法测定毒素

1.2.1 标准溶液的配制

标准储备液：分别取1 mg DON标准品、1 mg NIV标准品，分别用甲醇溶解并配置成100 μg·mL储备液，再将其分别配置成50 μg·mL标准储备液；取5 mg ZEN标准品，用甲醇溶解并配置成50 μg·mL母液，取10 mL母液配置成5 μg·mL标准储备液。标准储备液放入-20 ℃冰箱备用。

标准曲线溶液：通过计算，移取相应量的3种毒素标准储备液至3 mL离心管中，用水：乙腈(50:50，v/v)溶液混合并稀释，将稀释后混合溶液过0.22 μm滤膜，得到标准曲线溶液，其中DON、NIV含量分别为10.00、8.00、5.00、2.00、1.00和0.50 μg·mL；ZEN含量为5.00、2.00、1.00、0.50、0.10和0.05 μg·mL。三次重复。

1.2.2 样品前处理

将待测的小麦籽粒样品磨碎混匀，准确称取25.0 g置于250 mL三角瓶中，加入100 mL乙腈:水(84:16, v/v)混合溶剂混匀，35 ℃超声萃取 30 min；用定量滤纸过滤，吸取8 mL滤液于试管中，并加入80 μL乙酸；过Mycosep#226多功能净化柱，取4 mL净化液，于55 ℃氮吹干；加入1 mL流动相(水∶乙腈=50∶50，v/v)复溶，过0.22 μm有机滤膜后上机检测。三次重复。

1.2.3 色谱条件

采用Agilent 1290高效液相色谱仪；C18柱，2.1 mm×100 mm，1.8 μm；DON和NIV检测波长240 nm，ZEN毒素检测波长274 nm；流动相A为水(含0.1%乙酸)，B为乙腈。梯度洗脱：流动相0～3 min 5% B；3～9 min 10% B；9～16 min 92% B；16～18 min 50% B；18～20 min 10% B；流速为0～9 min 0.1 mL·min；9～20 min 0.15 mL·min。柱温35 ℃；进样量2 μL。

1.2.4 精密度及回收率计算

通过计算，分别移取相应量的3种毒素标准储备液至3 mL离心管中，用水∶乙腈(50∶50，v/v)溶液稀释，过0.22 μm有机滤膜，得到混合标准溶液。混合标准溶液中DON及NIV毒素含量分别为5、8和10 μg·mL，ZEN毒素含量分别为1、2和5 μg·mL。用UPLC法测混合标准溶液中毒素含量，连续测定5 d，每天重复3次，以测定日间、日内精密度。

精密度=重复结果的标准差/重复结果平均值×100%

以100 mL 84%乙腈-水溶液为空白样品，在空白样品中分别加入2.5 μg、25.0 μg、50.0 μg三种毒素标准品，配制成100 μg·kg、1 000 μg·kg、2 000 μg·kg三个标准样品，用UPLC法测定其含量并计算回收率。

回收率=(标准样品测定结果-空白样品测定结果)/标准水平值×100%

1.3 MFC-HPLC-DAD(以下简称HPLC法)法测定毒素

参照梁 坤的方法分别测定9个不同抗性小麦样品的DON、NIV和ZEN含量。同时测定DON、NIV含量，采用(250 mm×4.6 mm, 5 μm)C18色谱柱，流动相为水∶乙腈∶甲醇(90∶5∶5，v/v/v)，流速为1.0 m L·min，柱温40 ℃，进样量为20 μL，DAD检测波长为218 nm；ZEN含量测定，采用色谱柱为C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相为水∶乙腈∶甲醇(46∶46∶8，v/v/v)，DAD检测波长270 nm，柱温40 ℃，进样量为20 μL。3次重复。

1.4 数据处理

数据用EXCEL 2016进行统计及初步处理，用 GraphPad Prism 8.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 UPLC法的建立

2.1.1 标准曲线及定量限分析

结果(表1)表明，三种毒素标准曲线的相关系数()均大于0.994，说明其在一定检测范围(0.01～10.00 μg·mL)内线性关系良好。在仪器信噪比3(S/N)和10时所对应的浓度分别为检出限(LOD)和定量限(LOQ)，DON、NIV及ZEN毒素的LOD分别为15 μg·kg、78 μg·kg、18 μg·kg，LOQ分别为19 μg·kg、90 μg·kg、18 μg·kg。测定的三种真菌毒素的LOD和LOQ均低于《食品国家安全标准食品中真菌毒素限量》(GB2761-2017)中毒素限量标准。

表1 UPLC法DON、NIV、ZEN的标准曲线、检出限及定量限

2.1.2 精密度及回收率分析

精密度测定结果(表2)表明，本方法精密度均小于2%。回收率所测结果(表3)表明，回收率在80.25%～118.35%之间，相对标准偏差为 0.20%～1.92%，说明该方法重现性及回收率均良好。

表2 UPLC法DON、NIV、ZEN的精密度

表3 UPLC法DON、NIV、ZEN的回收率

2.2 UPLC与HPLC法保留时间、精密度和回收率比较

分别使用UPLC法与HPLC法测定不同浓度的三种毒素的混合标准溶液测定精密度时混合标准溶液中DON、NIV及ZEN毒素含量分别为5.00、5.00以及1.00 μg·mL；测定回收率时混合标准溶液中DON、NIV以及ZEN毒素含量皆为100 μg·kg。结果显示，在0.01～10.00 μg·mL内，三种毒素的标准曲线具有良好的线性关系，说明这两种方法的测量结果均准确、可靠。UPLC法同时测定三种毒素所需保留时间为14.68 min，而HPLC法不能同时测定ZEN与另外两种毒素，需要分2次前处理制备和上机，累积保留时间为25.19 min；两种方法的精密度均低于2%，精密度良好；UPLC法测定三种毒素的回收率均高于HPLC法。

表4 两种方法保留时间、精密度及回收率情况

2.3 UPLC法与HPLC法测定结果比较

分别使用两种方法对9个小麦材料中3种毒素含量进行检测，结果如表5所示，DON、NIV、ZEN的检出率在UPLC法中分别为77.78%、77.78%、29.62%，而在HPLC法中分别为 51.85%、62.96%、44.44%，说明UPLC法更灵敏；两种方法检出DON、NIV和ZEN值的相关系数分别为0.993、0.979和0.906，一致性良好。

表5 UPLC法和HPLC法DON、NIV、ZEN毒素含量测定结果

2.4 UPLC法对129个材料的检测结果

如图1所示，DON与NIV检出率分别为99%(128/129)和92%(119/129)，ZEN的检出率较低，为70%(90/129)。根据GB2761-2017中对小麦及小麦制品DON毒素和ZEN毒素的限量标准，DON毒素含量超标(>1 000 μg·kg)的品种有33份,占所测小麦品种的25%；ZEN毒素含量超标(>60 μg·kg)的为20份，占所测小麦品种的15%；我国尚未出台食品中NIV的限量标准，但NIV毒素含量>500 μg·kg的有17份，占所测小麦的13%。三种毒素累积量较低且符合标准(DON毒素含量≤1 000 μg·kg，NIV毒素含量≤500 μg·kg，ZEN毒素含量≤60 μg·kg)的共80个，占全部小麦材料的 62.01%，主要来自长江中下游麦区以及黄淮冬麦区南片。

a:DON毒素频率分布图；b:NIV毒素频率分布图；c:ZEN毒素频率分布图；No:未检出。

3 讨 论

小麦赤霉病严重影响小麦产量和品质，特别是真菌侵染后产生的多种镰刀菌毒素威胁食品安全。乳熟期前后小麦感染赤霉菌，病植株病症较轻、病情指数低，但籽粒毒素累积量高，难以通过发病情况来判断其毒素累积量。目前，对抗赤霉病育种的研究绝大多数集中在对抗扩展基因的应用上，缺乏对抗毒素累积/主动解毒机制的研究，不同品种小麦籽粒毒素累积量的测定是研究毒素累积抗性的第一步。对食品或饲料中的毒素测定方法很多，单一毒素检测如ELISEA或国标法薄层色谱法，均能满足食品检测的需求，但精确度较低，难以用于比较品种间的差异。小麦因赤霉病引起的镰刀菌毒素中威胁粮食安全的主要是DON、NIV和ZEN毒素，分别属于单端孢霉烯族和玉米赤霉烯酮，为保证检测的准确度而分别开展3种毒素的检测，不仅增加了前处理工作量和试剂成本，也降低了仪器通量。梁 颖建立液相色谱-质谱联用同时测定小麦面粉中DON、NIV和ZEN的方法，检出限为5～12 ng·g，具有很好的精密度；刘笑笑建立了超高效液相色谱串联质谱法，可同时检测包括DON、ZEN毒素在内的15种真菌毒素，检出限为0.2～15 μg·kg，精确度高，但前处理方法为较复杂的固相萃取法；质谱与HPLC或UPLC的联用能够提高检测精度，但质谱仪造价昂贵，一般实验室难以承担。本研究建立了基于MFC-UPLC-DAD法同时检测小麦中DON、NIV和ZEN三种毒素；检出限为15～78 μg·kg；回收率在 80.25%～118.35%之间，相对标准偏差为 0.20%～1.92%；本方法所采用的多功能净化柱前处理法无需淋化、洗脱等步骤，简化了前处理程序；缩短了测定3种毒素的色谱分析时间，大大降低检测成本。分别利用UPLC法和HPLC法对标准混合样进行重复性试验，结果显示，在 0.01～10 μg·mL内，三种毒素的标准曲线具有良好的线性关系，说明两种方法的测量结果均准确、可靠。UPLC法检测体系中流速为0.1～0.15 mL·min，低于HPLC法所需流速1.0 mL·min；UPLC法同时测定三种毒素所需保留时间更短，为14.68 min。利用这两种方法分别测定9个小麦品种的三种毒素累积量，测定结果差异不显著，且UPLC法毒素检出率更高。这两种方法均可满足实验室中对不同小麦品种毒素累积量精确分析的需求，但UPLC法低流速、短时间、前处理简单、可同时检测三种毒素，节省了检测时间和成本，提高了毒素测定的效率。

利用MFC-UPLC-DAD法测定自然发病的129份材料发现，符合限量标准且毒素含量较低的材料共80份，主要来自长江中下游麦区品种，例如扬麦158、扬麦14、镇麦9号和安农1581，这些品种赤霉病抗性大多表现为中抗及以上，这与该地区长期受赤霉病危害导致的选择压力有关；黄淮南片的品种西农899和西南麦区的贵农775在赤霉病抗性表现为中抗-中感，但三种毒素累积值均较低，可作为抗毒素累积育种的 亲本。

4 结 论

本研究建立了快速准确地同时定量分析小麦籽粒中DON、NIV和ZEN的MFC-UPLC-DAD方法。该方法操作简单、灵敏度高，三种毒素的检出限分别为78 μg·kg、15 μg·kg和18 μg·kg，远低于《食品国家安全标准食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2017)中的相关限量规定，可满足常规实验室快速、准确定性定量分析和比较不同小麦品种籽粒中赤霉病毒素污染情况的 需求。