华山新麦草2Ns染色体SCAR标记的开发

吕博雅，张珍悦，赵 李，李晓萍，李家创，白宇皓，刁慧珊，刘 洋，杨群慧，刘淑会，武 军，陈新宏

(1.西北农林科技大学农学院/陕西省植物遗传工程育种重点实验室，陕西杨凌 712100;2.陕西省兴平市种子管理站，陕西兴平 713100)

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，加快小麦育种进程，提高小麦产量、品质和抗逆性仍是小麦育种工作者的主要目标。但是，小麦遗传变异范围较窄、遗传多样性降低等因素阻碍了小麦育种的发展。利用远缘杂交技术可以将优良基因导入普通小麦，丰富小麦遗传多样性。华山新麦草(Keng)属于禾本科小麦族新麦草属，是中国秦岭山脉华山地区特有的小麦近缘野生种。华山新麦草具有早熟、多分蘖、多小穗、抗逆(抗旱、耐盐碱、耐瘠薄)、抗病(抗条锈病、白粉病和全蚀病)等优良性状，是小麦遗传改良的重要基因源。

为了利用华山新麦草中的优良性状，陈漱阳等在20世纪80年代开始了华山新麦草与普通小麦的远缘杂交，并获得了一批小麦-华山新麦草衍生后代。之后，傅 杰等、武 军等和Zhao等等也创造出了一系列的小麦-华山新麦草异附加系、异代换系和易位系。本课题组前期通过回交和自交，获得了一套农艺性状优良、抗病性强的小麦-华山新麦草全套(1Ns～7Ns)二体附加系。与此同时，研究者们还建立了鉴定和检测小麦-华山新麦草后代外源染色体或基因的方法，这些方法包括生化鉴定(同工酶、种子贮藏蛋白分析)，细胞学鉴定(C-分带、基因组原位杂交、荧光原位杂交)等。但远缘杂交后代稳定性差，分离复杂且数量庞大，以上方法成本高且耗时长，限制了华山新麦草在小麦遗传育种中的应用。而RAPD、EST-SSR、EST-STS和SCAR标记，成本相对较低，便于高通量分析，可有效地确定小麦背景中异源染色体的同源关系。其中SCAR标记(通常为18～24 bp)具有较高的特异性和可重复性，是鉴定植物的重要标记之一。利用RAPD、AFLP、SSR和ISSR技术，已开发出多种类型的小麦SCAR标记。陈林刚等利用200个RAPD随机引物，经BLAST分析和Southern杂交鉴定，筛选出3条华山新麦草基因组的特异重复序列，但尚未转化为SCAR标记。随后，研究者们利用RAPD标记开发了一系列特异性SCAR标记，包括5个Ns基因组特异性SCAR标记、1个1Ns染色体特异性SCAR标记、2个3Ns染色体特异性SCAR标记和3个5Ns染色体特异性SCAR标记。Du等也在278个SSR标记的基础上，开发了华山新麦草1Ns染色体特异性SCAR标记。截止目前，尚未见2Ns、4Ns、6Ns和7Ns染色体特异性SCAR标记的研究报道。

为获得华山新麦草2Ns染色体的特异性SCAR标记，本研究利用180个随机引物R1～R180(10 bp)拟先筛选出华山新麦草2Ns染色体上的PAPD分子标记，然后将其转化为特异性SCAR标记，并对SCAR标记的特异性进行验证，以期准确快速地筛选出小麦-华山新麦草杂交后代(特别是大批量衍生材料)中含有华山新麦草2Ns染色体的材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

亲本普通小麦7182(AABBDD，2=6=42)、华山新麦草(NsNs，2=2=14)以及一套完整的小麦-华山新麦草二体附加系(1Ns～7Ns，2=44=22II)共9份材料，均由西北农林科技大学农学院陕西省植物遗传工程育种重点实验室提供(表1)。

表1 试验中使用的材料

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取

采用CTAB法提取所有材料叶片的基因组DNA，使用ddHO稀释至工作浓度。

1.2.2 RAPD分析

使用180个随机引物(R1～R180)，以9个材料的基因组DNA为模板进行PCR扩增，筛选出华山新麦草特异RAPD标记。PCR反应体系为20 μL，包括2 μL 10×PCR Buffer，1.6 μL dNTPs(2.5 μmol·mL)，2 μL引物(5 μmol·mL)，2.5 μL模板DNA(100 ng·μL)，0.2 μL Taq酶(5 U·μL)，11.7 μL ddHO。反应程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，36.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，44个循环；72 ℃延伸10 min；12 ℃冷却后4 ℃保存。扩增完成后，加入5 μL Loading Buffer，使用8%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测，观察并拍照保存。

1.2.3 扩增产物的克隆和测序

使用OMEGA公司的聚丙烯酰胺凝胶回收试剂盒对仅在华山新麦草及其二体附加系中扩增出的特异性条带进行回收，然后连接到pMD19-T载体，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞。采用菌落PCR蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，送上海生物工程有限公司进行测序。

1.2.4 测序结果的分析与SCAR引物的设计

使用Oligo 7.37进行序列分析，并在NCBI网站使用BLASTn和BLASTx进行序列同源性比对。根据RAPD产物的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0设计候选SCAR引物。SCAR引物的设计包括18～22个碱基和相应RAPD片段框架内的结合位点，由北京奥科生物技术有限公司合成。

1.2.5 SCAR标记的检测与分析

以9个材料的基因组DNA为模板，对特异SCAR标记进行PCR检测。PCR反应体系同 1.2.2，反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min；12 ℃冷却后4 ℃保存。扩增完成后，使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测并分析。

2 结果与分析

2.1 2Ns染色体特异RAPD标记鉴定结果

用R1～R180这180个引物对9个供试材料进行初步筛选，共发现有26个特异引物，其中21个为华山新麦草基因组特异性RAPD标记，4个为华山新麦草其他染色体特异性标记，仅有1个引物R131(GTGCAACGTA)为2Ns染色体特异性标记。进一步利用R131引物对9个供试材料进行检测，结果(图1)发现，仅在华山新麦草及其2Ns二体附加系中扩增出一条约1 000 bp的特异性条带，而在其他6个二体附加系和普通小麦7182中均未扩增出该条带(图1)。因此，R131可以作为华山新麦草2Ns染色体的特异性标记。

1：1Ns二体附加系；2：2Ns二体附加系3：3Ns二体附加系；4：4Ns二体附加系；5：5Ns二体附加系；6：6Ns二体附加系；7：7Ns二体附加系；8：普通小麦7182；9：华山新麦草；M：DNA marker。箭头所示为华山新麦草及其2Ns二体附加系上的特异扩增产物。图4同。

2.2 序列分析

回收R131引物扩增出的华山新麦草2Ns染色体特异性条带，连接到pMD19-T载体，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌落PCR发现，阳性克隆可扩增出一条约1 000 bp的条带(图2)，对其进行测序，得到全长为1 126 bp的片段，命名为F，其序列如图3所示。序列分析表明，F的GC含量为50.9%，但没有发现内部串联重复序列、反向重复序列以及回文序列等特征。将该序列提交到NCBI数据库，登录号为MF405182。序列比对分析未发现NCBI数据库中有与F相同的序列，而URGI数据库中的BLAST搜索显示F的239个核苷酸(核苷酸238到536)与3DL染色体参考序列的同源性为80%，表明F与公共数据库中的序列无显著的同源性。

箭头表示单克隆菌落PCR扩增带FR-131。

2.3 特异性SCAR标记的设计与验证结果

根据F的克隆序列，利用Primer Premier 5.0设计特异SCAR标记引物S131，长度为561 bp。S131序列在图3中用双线表示，即S131-F：CAACCTGCCTAACTCTATGTCA和S131-R：CGACTTGGGGAGAAGGCTG。

双下划线部分表示SCAR标记S131的上、下游引物。

利用S131对9个供试材料进行验证，结果(图4)显示，仅华山新麦草及其2Ns二体附加系可扩增出561 bp的条带，而在其他材料中均未扩增出该条带，表明该条带是华山新麦草2Ns染色体所特有，即2Ns染色体特异条带。此结果证明，RAPD标记R131已成功转化为特异SCAR标记S131，可用于快速准确地鉴定华山新麦草2Ns染色体。

图4 SCAR引物R131在小麦-华山新麦草二体附加系及其亲本中的扩增结果

3 讨 论

在小麦育种中，利用小麦野生近缘植物中的优良基因可以提高小麦的产量、品质以及抗逆性。然而，只有当外源遗传物质较少时，连锁阻力减小，减数分裂行为趋于规则，这些外源优良基因才可以被小麦育种者利用，为了利用这些优良基因，在进一步产生易位系(特别是小片段易位系)之前，需要构建对应的附加系和代换系。因此，如何快速准确地鉴定外源染色体(片段)是否已转入普通小麦至关重要。

华山新麦草由于其具有良好的性状被世界各地的育种家作为重要的供体广泛利用。特别是2Ns染色体上含有可以增加小花数、穗粒数、分蘖数和穗长的基因，为提高小麦产量提供了新的遗传资源。另外，小麦-华山新麦草2Ns二体附加系和2Ns/2D二体代换系对条锈病具有较强的抗性，因此，华山新麦草2Ns染色体的抗条锈病基因可以改善小麦对条锈病的抗性，进一步提高小麦的产量潜力。鉴于小麦-华山新麦草2Ns二体附加系的优良性状，准确有效地将含有2Ns染色体的材料与大量的小麦-华山新麦草杂交后代区分开来具有重要的意义。虽然目前已经开发了RAPD、EST-SSR、EST-STS等标记，可用来筛选小麦-华山新麦草2Ns二体异附加系和异代换系，但与SCAR标记相比，它们操作复杂，成本更高。而SCAR标记只需要对每个植物样本进行一次反应，且具有更高的重复性、稳定性和特异性。研究证实，特异SCAR标记可用于高效、快速地鉴定目标物种中的外源染色体(片段)。

本研究用180个随机引物对一整套小麦-华山新麦草二体附加系及其亲本进行了筛选。在这些引物中，共筛选到21个华山新麦草基因组特异RAPD标记和5个华山新麦草染色体特异标记，华山新麦草染色体特异标记的筛查率明显低于其基因组特异标记。以前的研究已经证实了这一观点。由于RAPD标记的设计不依赖于华山新麦草的基因组序列，并且普通小麦与华山新麦草基因组序列之间几乎没有同源性，那么华山新麦草染色体特异性标记的筛选效率低于其基因组特异性标记可能是由于华山新麦草同源类群之间基因组序列的同源性相对较高。本研究只有1个RAPD引物成功转化为稳定的SCAR标记，表明从RAPD标记转化为SCAR标记的效率较低，这与苏佳妮等的观点一致。在本研究中，RAPD标记的退火温度由前人研究的32.0～34.0 ℃被优化为36.9 ℃，可以消除非特异性条带。因此，本研究开发的华山新麦草2Ns染色体SCAR标记的特异性更高，更稳定，根据特定条带的存在与否，对结果更容易观察判断，有利于大量样品的快速分析。华山新麦草染色体特异性SCAR标记如1Ns、3Ns和5Ns染色体特异性SCAR标记已有报道。未来的研究中，可进一步开发华山新麦草其他染色体上的SCAR标记，为华山新麦草在小麦育种中的高效利用奠定基础。

4 结 论

本研究利用RAPD技术开发了一个特异性SCAR标记S131，可用于快速、准确地筛选含有2Ns染色体的小麦-华山新麦草杂交后代，为利用2Ns染色体上的优良基因奠定基础。RAPD和SCAR的结合为追踪华山新麦草及其他物种的染色体(片段)提供一种简单、可靠的方法。