HIF-1α与MALAT-1在三阴型乳腺癌中的表达及其相关性分析

李泽群 何艳 唐剑

广东深圳市龙岗中心医院 1)甲乳血管外科 2)病理科 3)妇科 深圳 518116

三阴型乳腺癌(TNBC)是癌组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体-2(HER-2)均呈阴性表达的乳腺癌，其发生率占乳腺癌所有病理类型的10.0%～20.8%。TNBC临床以侵袭性病程为主要表现，与其他乳腺癌类型比较，发生远处转移的风险较大且预后较差[1]。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是一种具有转录活性的核蛋白，主要由HIF-1α与HIF-1β组成，其中α是由缺氧诱导的活性亚基，具有调节活性的功能[2]。大量文献表明[3-4]，HIF-1α能在众多肿瘤疾病组织中呈高表达，且与肿瘤组织的血管生成、侵袭转移、放化疗的抵抗性等密切相关。MALAT-1能够参与并调控腹膜纤维化的进展，且MALAT-1在乳腺癌患者中呈异常表达，能参与癌细胞的迁移、侵袭及增殖，但目前对于两者在TNBC患者中的表达与相关性研究鲜有。鉴于此，本研究拟分析HIF-1α与MALAT-1在TNBC中的表达及其相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料回顾性分析2010-10—2020-10我院收治的63例TNBC患者的临床资料。纳入标准：(1)符合《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2017年版)》[5]中的相关标准，ER、PR及Her-2检查均为阴性。(2)均为女性患者。(3)临床资料完整。排除标准：(1)术前已接受放化疗、内分泌等相关治疗者。(2)合并其他部位恶性肿瘤者。(3)妊娠或哺乳期患者。年龄(45.46±8.79)岁(范围：36～54岁)。临床TNMⅠ期35例，Ⅱ期22例，Ⅲ期6例。有淋巴结转移21例，无淋巴结转移42例。

1.2方法

1.2.1 MALAT-1染色与判定 采用SP法检测HIF-1α。对手术切除的癌组织及癌旁组织标本进行低聚甲醛固定，采用石蜡包埋，连续切片、脱蜡、水化、抗原修复，血清封闭后进行4℃的孵育过夜。二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)显色，采用苏木精进行复染后进行反蓝冲洗。采用磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)代替一抗做阴性对照。结果以染色强度与阳性细胞百分比进行判定，若细胞核或细胞质无染色或轻微染色则为阴性；若细胞核或细胞质染色较强，且阳性细胞数比例≥50%，或细胞核(或细胞质)出现强染色且阳性细胞数比例≥10%，则为阳性。

1.2.2 引物合成 选择甘油醛-3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase,GAPDH)，所有引物选择聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)纯化级别。MALAT-1上游引物为5’-TGC CCA TTC ACT GCC TCC T3’；下游引物为5’-TGC CGA CCT CAC GCA GGA TTT T-3’，扩增产物片段长度为93 bp。HIF-1α上游引物为5’-TCC AAG CCC TCC AGG TAT-3’；下游引物为5’-ATG CTA AAT CCC TCC AAG TAT-3’；下游引物为5’-ATG CTA AAT CGC AGG GTA-3’，扩增产物片段长度为568 bp。

1.2.3 RT-PCR检测 采用Trizol法提总RNA，所有操作严格按照说明书进行。B-500超微量紫外可见分光光度计测定RNA浓度，2.0μL5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、500ng总RNA，加入10μL RNaes Free ddH2O，PCR仪42℃进行2 min水浴。反转录合成cDNA放置于-80℃的冰箱中保存待检，PCR反应体积为20 μL，其中SYBR Green PCR Master Mix10μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL；cD-NA模板2 μL，RNase free水为6.8 μL。循环参数：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共循环40次。采用2-△△CT法获得MALAT-1与HIF-1αmRNA的表达水平。

2 结果

2.1HIF-1α蛋白阳性率和MALAT-1、HIF-1α表达水平癌组织的HIF-1α阳性率高于癌旁组织， MALAT-1、HIF-1α的表达水平均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 TNBC癌组织与癌旁组织HIF-1α蛋白阳性率及MALAT-1、HIF-1α表达水平比较

2.2TNBC患者MALAT-1与HIF-1α表达水平相关性分析经双变量Pearson直线相关检验结果显示，TNBC患者MALAT-1与HIF-1α呈正相关(r=0.358，P<0.05)。

3 讨论

TNBC的病因尚未完全明确，多认为与乳腺癌相关基因(BRCA1/2)导致疾病突变密切相关。文献资料表明[6]，乳腺癌患者中部分IncRNA能够通过对下游靶基因的调节作用而促进癌细胞的增殖，且能通过与体内的受体某些片段DNA结合对受体的表达造成影响，最终导致肿瘤细胞的凋亡敏感性发生改变，但仍局限于对乳腺癌组织或细胞中。因此，寻找新的生物学标记物对了解TNBC的复发与转移机制，提高TNBC患者的生存率，减少复发与转移具有重要意义。

本研究结果显示，癌组织的HIF-1α阳性率高于癌旁组织，且癌组织MALAT-1和HIF-1α表达水平高于癌旁组织。结果提示癌组织的MALAT-1、HIF-1α呈高水平表达。这可能是由于在肿瘤细胞的微环境中，肿瘤新生血管无法满足无限增殖的肿瘤细胞，进而出现氧浓度降低，其中天冬酰氨胺羟化酶(PHDs)、脯氨酸羟化酶(PH)相继失活，导致下游靶基因HIF-1α转录被激活。HIF-1作为临床具有转录活性的核蛋白，与靶基因结合后能够通过转录与转录后的调控作用导致机体发生有适应代偿性质，或病理性损害的反应。Soni S[7]等通过对HIF-1在生物学和治疗癌症中近20年重要文献分析发现，HIF-1作为网络枢纽可协调影响肿瘤发生的多种信号分子活动，在肿瘤组织的血管生成、能量代谢，以及侵袭转移中有重要的地位。其可在多种肿瘤组织中呈异常表达，且与肿瘤的转移及预后密切相关。Wang Y[8]等通过对Malat-1表达升高对乳腺癌患者长期不良预测的Mate分析发现，其对乳腺癌患者的生存结局有重要预测作用，本研究结果与之近似。进一步经双变量Pearson直线相关检验，结果显示，TNBC患者MALAT-1与HIF-1α呈正相关。提示HIF-1α表达水平越高，则MALAT-1的表达越高。分析原因，可能是由于MALAT-1能够作用于G2/M细胞周期，可经P13K/mTOR通路对细胞的增殖与凋亡进行调控，进而参与TNBC的发生与发展[9]。HIF-1α则在低氧反应下与反应元件结合，激活下游靶基因的转录表达，从而呈高水平表达。

综上所述，TNBC患者的HIF-1α与MALAT-1的表达水平呈正相关，临床可加强对两者水平的监测，以判断病情的严重程度。