小反刍兽疫病毒在Vero细胞中生长特性

文│次仁拉姆（西藏自治区兽医生物药品制造厂）

小反刍兽疫（Peste des petits ruminants，PPRV）也称作小反刍兽假性牛瘟、口炎肠肺炎综合征等，是由小反刍兽疫病毒引起的烈性传染病。调查发现，该病主要感染对象为小反刍兽，以山羊最为常见。现阶段，并未发现感染人的病例。小反刍兽疫病毒和犬瘟热病毒、牛瘟病毒、牛麻疹病毒、海豹瘟病毒等相类似，它们均属于副粘病毒科麻疹病毒属成员。该病最早发生于1942年，在非洲西部的象牙海岸首次暴发，随后被命名称作小反刍疫病。小反刍兽疫几乎在全球范围内均有暴发，主要集中在亚洲和非洲的40多个国家。该病对畜牧业造成了严重影响，尤其是山羊和绵羊等养殖产业。在感染后，小反刍兽疫病毒通常对小反刍兽的上呼吸道淋巴样组织、胃肠道有显著的亲和力，进而出现病理性变化。此外，该病毒主要通过气溶胶进行传播，从上呼吸道上皮组织入侵机体以后，迅速扩散到全身部位，机体的排泄分泌物为主要的感染源。通常情况下，已被感染的动物可通过分泌物与排泄物进行排毒，近距离的接触会感染其他动物。在感染后的两天时间内，可以通过检测动物分泌物来进行判断。

调查研究发现，在干燥、低温及存在风沙的情况下，更容易出现细菌与小反刍兽疫的混合感染，并且在动物感染以后，其胚胎和精液中就会出现病毒，该种病毒也会通过受精作用或者胚胎移植进行传播。因此，通常被感染的动物在其潜伏期为主要的感染源。小反刍兽疫会对小反刍兽健康带来严重危害，已被列入一类动物疫病。针对小反刍疫病必须严加防范，及时采用有效措施进行预防。基于此，本研究通过对小反刍兽疫病毒在Vero细胞上的致细胞病变反应予以分析，完成对接种毒液的小反刍兽疫病毒数据的测定，给疫苗生产奠定基础。

一、材料与方法

1.设备仪器。二氧化碳培养箱:德国Hearcell生产；倒置显微镜：上海光密仪器有限公司；生物安全柜：上海力申科学仪器公司；细胞观测台；细胞转瓶机

2. 毒株选择。原始毒株为clone9株，该毒株由中国兽医药品监察所提供。

3.细胞选择。在小反刍兽疫病毒培养应用到的细胞为Vero传代细胞，属于非洲绿猴的肾细胞。（注：来源于生物药品制造厂所保存的Vero细胞。）

4.细胞的复苏。

（1）在进行细胞复苏操作前半小时打开无菌室的A级洁净度，对操作场所用苯酚5%消毒灭菌，并且用75%的酒精擦拭操作桌面。

（2）将冻存管迅速由液氮转入到37℃水浴中（以防止-5℃二甲基亚砜对细胞的损伤）冻存管的顶部保持在水面上，以避免任何的污染，还要不定时地搅拌加速解冻。

（3）当细胞完全解冻后，用75%酒精擦拭冻存管，用离心机离心后，倒掉上清液，用营养液吹打使细胞完全分散，将细胞转移到25平方厘米的克氏方瓶中，并加5%～8%的新生牛血清后在37℃温室里培养。

5. 细胞传代与接毒的操作步骤。

（1）在进行细胞系传代操作前对实验场所进行消毒灭菌20分钟，并点燃酒精灯，用75%酒精棉将手擦拭一遍。

（2）将EDTA-胰酶溶液放在37℃的恒温水浴箱中预热。

（3）将待传代的细胞培养瓶用75%酒精擦拭一遍后放在操作台上。

（4）将细胞瓶中原有的细胞生长液倒入废液缸中，在火焰的保护下用吸管向内加入适量磷酸盐缓冲液（PBS），以洗去细胞上存留的血清和营养液，然后倒掉PBS液。

（5）向细胞瓶加入适量的消化液即EDTA-胰酶溶液，轻轻摇动细胞瓶，使细胞与消化液充分接触，提高消化效率，然后水平放置在桌面上。

（6）当细胞表面出现肉眼可见的毛玻璃样，或出现针尖大小的缝隙时即可倒掉细胞消化液，平放在台案上。

（7）待细胞面出现较大的裂痕时，细胞脱离瓶壁，此时细胞在胰酶的作用下仍继续消化。

（8）用吸管向已消化好的细胞瓶中加入细胞生长液（营养液）将细胞冲下并轻轻吹打以充分分散细胞，此时细胞停止消化。

（9）根据细胞密度，确定适宜分散率，根据分散率补足细胞生长液，将细胞生长液充分混匀，在酒精灯火焰保护下，均匀的分装在细胞瓶中。

（10）将细胞瓶上注明传代细胞的系名称、日期等信息，在37℃的温室中培养。 将温度控制在37℃，在温室培养48小时～72小时后，选择生长较好的Vero细胞单层，进行接毒，对小反刍兽疫病毒毒种按照细胞生长液的2%进行接种，将其放置在37℃温室进行转瓶培养，培养96小时～120小时，观察小反刍兽疫病毒致细胞病变的情况、并按照病变情况进行收毒。

6. 获取病毒生长相关数据。小反刍兽疫病毒的种毒clone9株，在经过接种以后得到长满Vero细胞单层的瓶体，分别培养不同时间获得相对应的病毒（此次研究可按照24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时进行统计）。每瓶细胞应在规定观察时间内，按下述标记录病变程度。-:细胞正常。+：病变细胞约占25%。++：病变细胞约占50%。+++：病变细胞约占75%。#：病变细胞约占75%以上，或有脱落细胞。操作中需设置重复和阴性对照，经过冻融3次处理以后，应用病毒含量（TCID50）方法准确测定毒价。

二、结果

1.观察Vero细胞的病变过程。按照此次实验阶段用于培养小反刍兽疫病毒使用的Vero传代细胞，在不同时间点获得Vero细胞的病变过程，详细情况见图1。

◎图1 生物药品制造厂所保存的Vero细胞病变过程示意图

2. 细胞接毒后病毒含量测定检验，按照以下操作过程。

（1）在离心管中将病毒液10倍倍比稀释处理，整个范围控制在10-1～10-6。

（2）把稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每个稀释度5个重复，各个孔接种量保持在100微升。

（3）在各个孔中加入对应的细胞悬液，使细胞量控制在20万～30万/毫升。

（4）以正常细胞作为对照，培养144小时，期间每天观察病变的变化情况，并对结果进行统计。

具体操作示意见图2。

◎图2 操作示意

三、结果分析

1.细胞病变过程。在对小反刍兽疫病毒进行分离与培养期间，必须要有细胞培养物作为支持，此次研究过程采用Vero细胞。小反刍兽疫病毒感染后可以诱导宿主细胞使其成为合胞体，合胞体的核主要按照环状进行排列，拥有类似于表盘状的外观结构。尤其是在羊的原代细胞培养物中，小反刍兽疫病毒展现出来的诱导过程更为显著，特征结构较明显，总体上病变细胞呈圆形拉丝状并具有折射力。

结合Vero细胞的细胞病变特征，发现在细胞病变初期，细胞间隙会变大，有少量的细胞堆积到一起形成团状结构，并且多个细胞在相互融合的条件下能够呈现为多核状态。而在细胞的中央部位存在团状的细胞质，在其周围拥有散射状的折光环。同时，总体上细胞在64个小时左右就出现了合胞体，并且在细胞融合以后，其速度在加快、细胞融合的数量也在增多，最终变化为蜂窝状的结构。在此阶段病变特征极其明显，紧接着合胞体会逐渐连接成片状，合胞体变大，附近出现较明亮的光环。细胞达到144个小时后，开始出现脱落的迹象，在此条件可把细胞进行回收处理。

2.病毒生长过程分析。观察小反刍兽疫病毒的生长情况，总体上在24个小时就进入到增殖阶段，并且在48到96小时期间增殖速度较快，后期增殖速度开始减缓，且在120个小时病毒含量接近较高水平，这也反映出小反刍兽疫病毒在Vero细胞中的增殖情况。

3.TCID50检验结果。采用karber法进行统计计算，按照lgTCID50＝L－d（s－0.5），其中L为最高稀释度的对数，d为稀释度对数之间的差值，s为阳性孔比率总和。最终检测出将该病毒稀释10-3.875接种100微升时可使50%的细胞发生病变。