健脾敛疮方对溃疡性结肠炎小鼠保护作用的机制研究*

张雪侠，钟 鑫，刘方洲，刘长河，周 敏，何颖欣，郭晓燕

(1.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004；2.郑州卷烟厂康复医院，河南 郑州 450004；3.郑州大学，河南 郑州 450001)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种非特异性的慢性炎症疾病，临床以腹痛、腹泻、脓血便为特征，发展为结肠癌的概率较高，炎症反应起着重要的作用[1-2]。研究[3-4]表明，UC发生后，机体迅速产生白细胞介素-1β(IL-1β),引起炎症介质释放，同时刺激肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等更多细胞因子的释放，加重炎症反应，造成机体损伤。花生四烯酸(AA)是炎症反应的重要介质，可被其限速酶环氧合酶-2(COX-2)和5-脂氧化酶(5-LOX)催化，从而产生代谢物前列腺素E2(PGE2)、白三烯B4(LTB4)等，分别在炎症的启动、发展中起着重要作用[5-6]。有研究发现，花生四烯酸(AA)与肠道疾病有密切关系[7-8]，UC的发展伴随着COX-2/5-LOX的激活和PGE2/LTB4含量的增加[9]。健脾敛疮方由葛根5份、黄芩4份、川黄连2份、广木香2份、乌药4份、白扁豆10份、山药10份、太子参4份、砂仁3份、山楂炭5份、车前子5份、甘草片1份、红枣1份组成，其作用机制尚不清楚。本研究以质量分数40 g/L葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠UC模型为研究对象，采用健脾敛疮方治疗，观察对AA代谢中两个主要酶COX-2和5-LOX表达的影响，从而探讨健脾敛疮方对UC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠50只，雄性，42～62 d，体质量20～25 g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物质量合格证号为11400700362621，饲养在河南省中医药研究院实验动物中心[设施使用许可证号为SYXK(豫)2019-0001]，设施使用证明号00014258。

1.2 药品、试剂与仪器

健脾敛疮方组成：葛根、黄芩、川黄连、太子参、白扁豆、山药、砂仁、广木香、乌药、山楂炭、车前子、甘草片、红枣。药材均购于亳州市张仲景中药饮片有限责任公司，经河南省中医药研究院中药研究所的刘长河副研究员鉴定为正品。药液由河南省中医药研究院制剂室制备。将上述药材按照1∶10的比例与去离子水混合，静置浸泡，然后倒入高压提取罐内进行提取浓缩，高温消毒后放在4 ℃冰箱保存备用，使用时配制成适当的质量分数。

DSS,美国MP Biomedicals有限责任公司产品，批号Q7418；美沙拉嗪，葵花药业集团有限公司产品，产品批号181019；PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附试验试剂盒,均为武汉伊莱瑞特生物工程有限公司产品，批号依次为E-EL-0034c、E-EL-0061c、E-BC-K035-M、E-BC-K020-M；兔抗COX2，武汉三鹰生物技术有限公司产品，批号10003388；兔抗5-LOX、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体，艾博抗生物技术有限公司产品，批号依次为ab169755、ab-181602；ECL显影液，博士德生物技术有限公司产品，批号AR1172。Synergy NEO型全功能酶标仪，美国BioTek仪器有限公司产品；DYCZ-24DNX型电泳仪和DYCZ-40D型转膜仪，均为北京六一仪器厂产品；Ti型显微镜，日本Nikon映像仪器销售有限公司产品；Fluor Chem R凝胶成像分析仪，美国Protein Simple公司。

1.3 模型的建立、动物分组与给药

小鼠适应性喂养3 d，按照体质量根据随机数字表法分为正常对照组、模型对照组、美沙拉嗪组、中药高剂量、中药低剂量组5组，每组10只。除正常对照组外，其余各组饲喂质量分数40 g/L DSS制备UC模型[9]。造模开始的同时进行灌胃给药，美沙拉嗪组给予美沙拉嗪溶液0.42 g/kg体质量，中药高、低剂量组分别给予健脾敛疮方药液16.6，8.3 g/kg体质量，正常对照组和模型对照组给予去离子水，灌胃体积均为0.02 mL/g，1 d 1次，共7 d。末次给药2 h后处死动物获取样本进行后续的实验。

1.4 检测指标与方法

1.4.1 结肠黏膜损伤指数(CMDI)及组织病理学改变

给药结束后解剖各组小鼠，取出相同部位结肠组织测量长度，并剖开观察结肠组织，进行CMDI判定，并进行苏木精-伊红(HE)染色观察。

CMDI按照参考文献[10]的标准。0分：结肠无损伤。1分：结肠轻度水肿但没有溃疡。2分：充血且肠黏膜粗糙呈颗粒状。3分：结肠黏膜溃疡形成，直径0～1 cm。4分：结肠黏膜溃疡形成，直径1～2 cm，但肠管与外周脏器无粘连。5分：溃疡直径 1～2 cm，肠管增厚，与周围脏器粘连严重。

1.4.2 结肠组织中LTB4、PGE2、TNF-α、IL-1β含量

采用酶联免疫吸附法检验。末次给药后，留取结肠组织，匀浆，分离上清，按试剂盒说明书方法检测LTB4、PGE2、TNF-α、IL-1β的含量。

1.4.3 结肠组织中5-LOX和COX-2蛋白含量表达

采用蛋白质免疫印迹法检测。用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取结肠组织总蛋白，BCA法定量蛋白浓度，变性后取等量蛋白经SDS-PAGE分离后转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭，2 h后弃封闭液，TBST缓冲液漂洗后加入COX-2(1∶1 000)、5-LOX(1∶1 000)一抗，4 ℃过夜，滴加二抗(1∶2 000)室温孵育1 h，洗膜后加入ECL显色液曝光拍照，用Image J软件分析，以目的条带灰度值/GAPDH灰度值表示蛋白表达水平。

1.4.4 结肠组织LTB4、PGE2、5-LOX、COX-2 mRNA的表达

采用聚合酶链反应法(PCR)检测。取各组小鼠结肠组织，将组织研磨碎，加入1 mL Trizol裂解，分别提取各组总RNA。逆转录为cDNA，逆转录反应条件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。以cDNA为模板扩增5-LOX、COX2，以GAPDH为内参照。引物序列见表1。PCR扩增条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，40个循环。

表1 逆转录PCR引物序列

1.5 统计学方法

2 结 果

实验中，由于造模原因，模型对照组死亡1只，美沙拉嗪组2只，中药高剂量组3只，中药低剂量组2只。

2.1 各组小鼠结肠长度、CMDI值和组织病理学形态对比

与正常对照组对比，模型对照组小鼠结肠长度变短、CMDI值变大，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组比，美沙拉嗪组、中药高剂量组小鼠结肠长度变长，CMDI值变小，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 各组小鼠结肠长度和CMDI值对比

正常对照组小鼠结肠黏膜完整均匀，隐窝结构规则，无炎症细胞浸润。模型对照组小鼠结肠黏膜层厚薄不均匀，隐窝结构改变，细胞排列紊乱，部分腺体消失，大量炎症细胞浸润，个别区域出现陈旧性病变，肠腔内有纤维素样病变及细胞坏死碎片。美沙拉嗪组小鼠黏膜层局部出现厚薄不均匀，腺体有炎症细胞浸润，肠腔内有少量纤维素样病变，较模型对照组显著减轻。中药高、低剂量组小鼠结肠黏膜层结构变化、炎症浸润和肠腔病变与模型对照组对比有明显减轻，以中药高剂量组减轻更为明显。见图1。

图1 各组小鼠结肠组织病理形态学对比(HE染色)

2.2 各组小鼠结肠组织PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β含量对比

与正常对照组对比，模型对照组PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型对照组对比，美沙拉嗪组、中药高剂量组PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β含量降低(P<0.01);中药低剂量组虽降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠结肠组织PGE2、LTB4、TNF-α、IL-1β含量对比

2.3 各组小鼠结肠组织中5-LOX和COX2蛋白表达对比

与正常对照组对比,模型对照组小鼠结肠组织中5-LOX和COX-2表达水平升高(P<0.01)；与模型对照组对比，各给药组小鼠结肠组织中5-LOX和COX-2表达水平降低(P<0.01)。见表4、图2。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.美沙拉嗪组；D.中药高剂量组；E.中药低剂量组

表4 各组小鼠结肠组织中5-LOX和COX-2蛋白表达对比

2.4 各组小鼠结肠组织中5-LOX和COX-2 mRNA表达对比

与正常对照组比较,模型对照组小鼠结肠组织中5-LOX和COX-2 mRNA表达水平升高(P<0.01)；与模型对照组比较，各给药组小鼠结肠组织中5-LOX和COX-2 mRNA表达水平降低(P<0.01)，见表5。

表5 各组小鼠结肠组织中5-LOX和COX-2 mRNA表达对比

3 讨 论

目前，溃疡性结肠炎的治疗药物有水杨酸制剂、糖皮质激素和生物制剂等。美沙拉嗪是临床治疗轻中度UC的常用药，可以抑制前列腺素和白三烯的释放，抑制炎症反应的发生，减少肠黏膜损伤[11]，但部分患者易出现耐药性。因此，寻找毒副作用小的天然药物具有重要意义。以DSS制备UC模型[12]，诱发肠道的炎症反应从而导致肠黏膜损伤和炎性细胞的浸润，类似于人类UC症状及组织学改变，是目前研究 UC 病因病机及药物治疗的最常用的造模方法[13-14]。

中医学认为，该病多因外感时邪、饮食不节、情志内伤、素体脾肾不足所致,病位在大肠,温热蕴肠、气滞络瘀为基本病机，脾虚失健为主要发病基础，饮食不调和情志内伤是主要发病诱因[15]。健脾敛疮方中葛根为君药，甘辛而凉，入脾胃经，既能解表退热又能升发脾胃清阳之气而治下利。黄连、黄芩为臣药，苦寒，清热燥湿，厚肠止痢。太子参益气健脾渗湿，白扁豆、山药健脾益气兼能止泻；砂仁、木香醒脾和胃，行气化滞；乌药辛温，行气止痛，温肾散寒；山楂炭性微温，味酸甘，入脾、胃、肝经，有消食健胃、活血化瘀、收敛止痢的功能；车前子性味甘寒，入肾、膀胱、肝、肺经，有利水通淋、渗湿止泻的作用。以上诸药共为佐药。甘草片和大枣共用，健脾和中，调和诸药，为使药。全方清湿热，补中气，渗湿浊，行气滞，使脾气健运、湿邪得去，诸症自除。研究[16]表明，治疗UC的药物主要以补益药和清热药为主，其中木香、黄连、甘草片等是UC治疗用药网络中的核心。本研究首次基于AA通路研究健脾敛疮方治疗UC的机制，以期为UC患者的治疗提供理论依据。

结肠长度及组织病理学改变是UC研究中衡量结肠损伤的重要指标，可评价药物对 UC 小鼠结肠组织炎症及损伤的治疗效果。炎症是UC的中心发病机制，涉及各种细胞因子[17]。TNF-α是启动UC发病的主要的炎性细胞因子，参与并促进肠黏膜的炎症反应，故被认为是UC发病的祸首因子[18]；此外，其还可加重炎症反应[19]。IL-1家族有IL-1α、IL-1β和IL-1受体拮抗剂，其中IL-1β是促炎作用最强的细胞因子。正常情况下，IL-1受体拮抗剂可以阻断IL-1的促炎作用，但UC患者体内的IL-1受体拮抗剂和IL-1β严重失衡，IL-1β水平增高，加重了肠黏膜的炎症反应[20]，从而引起一系列的病理改变导致UC的形成[21]。本研究结果显示，UC发生时小鼠结肠长度缩短，CMDI值增大，血清中TNF-α、IL-1β含量升高。给予药物处理后，美沙拉嗪组和中药高剂量组小鼠的结肠长度变长、CMDI值变小，血清TNF-α、IL-1β水平降低，结肠的组织病理损伤得到显著改善。此说明健脾敛疮方可以增加UC小鼠的抗炎能力。

AA是一种存在于细胞膜中的多不饱和脂肪酸，是合成促炎介质的重要前体，与炎症[22]、脂质过氧化和铁死亡[23]等有密切联系。研究显示，抑制AA代谢对UC具有明显治疗作用[24]。环氧合酶(COX)和脂氧化酶(LOX)是AA进一步代谢为炎症介质的主要途径，LOX可将AA代谢为白三烯等促炎介质，其中LTB4不仅可激活白细胞产生趋化作用，还可通过释放内含髓过氧化酶的溶酶体酶产生过氧化物阴离子[25]。在COX途径中，AA被COX催化为具有多种生物活性的前列腺素E，而前列腺素E在调节免疫细胞分化及促进细胞因子表达过程中均具有重要作用。本研究结果显示，给予药物干预后，UC小鼠结肠组织中5-LOX和COX-2蛋白和mRNA表达水平降低，血清中炎症代谢物PGE2、LTB4含量降低，提示健脾敛疮方可能通过抑制AA代谢通路发挥抗炎的保护作用。

综上所述，健脾敛疮方能够抵抗质量分数40 g/L DSS诱导的UC，保护结肠损伤，其具体作用机制可能与抑制AA代谢通路发挥抗炎的保护作用有关。本研究证实了AA代谢通路在健脾敛疮方对UC作用机制中的作用，AA代谢物与铁死亡相关，UC是否与铁死亡相关，需要进一步深入的研究。