陕西某羊场莎能奶山羊球虫分离鉴定及感染情况

高嘉淇，王逸群，王玥婷，袁晨阳，梁高星，李 媛，王 一，宋军科

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100)

山羊球虫病是由寄生于山羊肠道的艾美耳科(Eimeiridae)艾美耳属(Eimeria)的多种球虫引起的一种寄生性原虫病。可寄生于山羊肠道的球虫种类繁多，目前国内外公认的山羊球虫主要有9种，分别是雅氏艾美耳球虫(E.ninakohlyakimovae)、阿氏艾美耳球虫(E.arloingi)、柯氏艾美耳球虫(E.christenseni)、艾氏艾美耳球虫(E.alijevi)、家山羊艾美耳球虫(E.hirci)、约氏艾美耳球虫(E.jolchijevi)、阿普艾美耳球虫(E.apsheronica)、山羊艾美耳球虫(E.caprina)和羊艾美耳球虫(E.caprovina)[1]。山羊球虫病是山羊最常见、危害最为严重的寄生虫病之一，呈世界性分布，各年龄段的山羊对球虫均有易感性。青年羊和成年羊感染后可出现下痢、消瘦、贫血、发育不良等临床症状，使羊生长缓慢及生产性能下降[2]。球虫感染羔羊后危害极大，除导致严重腹泻外，还可使羔羊大批死亡，病死率可达80%以上，对羊的健康和养羊业造成很大威胁[3-4]。在生产实践中，球虫体积微小、形态相近，应用常规方法很难快速准确地进行种类鉴定，因此给山羊球虫病的有效防控带来极大的挑战。目前国内外对山羊球虫病已经有了一些研究，但陕西地区山羊球虫病的调查研究鲜见报道。加之，奶山羊产业是中国畜牧业和乳品行业的重要组成部分，也是陕西省畜牧业的传统优势特色产业，陕西省奶山羊存栏量、羊奶产量等均稳居全国首位[5-6]。因此，本研究对陕西省某羊场莎能奶山羊的球虫感染情况进行调查研究，进一步对分离到的球虫卵囊进行分离和种类鉴定，以期为该地区山羊球虫病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 粪便样品

从陕西省某羊场采集莎能奶山羊粪便样品共49份，其中，6～12月龄山羊14份，3～5月龄羔羊13份，2月龄羔羊22份(表1)。

表1 不同年龄段山羊粪便样品采集情况

1.2 仪器与设备

60目铜筛，购自浙江省上虞市大亨桥化验仪器厂；4 ℃冰箱、铁丝圈、50 mL离心管、麦克马斯特计数板、显微成像系统，购自尼康仪器(上海)有限公司；L-550台式低速离心机，购自长沙湘仪离心机仪器有限公司；隔水式恒温培养箱，购自上海精宏实验设备有限公司。

1.3 主要试剂

NaCl、重铬酸钾、去离子水等。

1.4 样品采集与保存

将采集到的新鲜粪便样品分别装入干净塑料袋内，标记年龄信息、粪便状态和山羊整体状态， 4 ℃冰箱保存。

1.5 粪便检查与OPG统计

根据龚振兴等[7]的研究结果，采用饱和食盐水漂浮法对粪便样品进行光学显微镜下检查，并采用麦克马斯特计数法[8]测定每克粪便样品中的球虫卵囊数(OPG值)。

1.6 球虫卵囊的分离与培养

将不同年龄段山羊粪便以腹泻与否为标准，将定量检测后剩余的粪样加入适量水研磨并充分混合后经60目铜筛过滤，滤液3 500 r/min 离心5 min 2次，沉淀加入饱和食盐水后混匀，1 700 r/min离心5 min，用吊环吊取最上层液面至清水中，重复2～3次至镜检后发现卵囊数较多即可。加入上清1.5倍体积的清水混合后，4 000 r/min离心8 min 2次，弃上清，沉淀即为收集的卵囊。取适量分离所得卵囊于20 mL含量为5%的重铬酸钾溶液中孵化(温度为28.5 ℃)，待球虫卵囊孢子化率达80%后，存至4 ℃冰箱。

1.7 卵囊的纯化与富集

经培养孢子化的卵囊于5 000 r/min 离心8 min 2次，所得沉淀即富集的卵囊。

1.8 卵囊的形态学鉴定

通过光学显微镜观察富集的孢子化卵囊，根据孢子化卵囊的形态学结构特征(卵囊大小、卵形指数、极帽、卵膜孔、子孢子大小、折光体、斯氏体、内残体、外残体、极粒等)，并结合文献资料进行球虫形态学鉴定[9-10]。

2 结果与分析

2.1 不同年龄段山羊球虫感染率

研究结果显示(表2)，该羊场山羊各年龄段普遍存在球虫感染，总感染率为98.0%(48/49)，其中 3～5月龄山羊和6～12月龄山羊感染率最高，达100%(27/27)。

表2 山羊的球虫感染率

2.2 不同年龄段山羊粪便OPG值

由表3可知，该羊场3～5月龄羔羊球虫平均OPG最高，为2 442个/g，6～12月龄山羊球虫平均OPG最低，为369个/g。但2月龄羔羊中检出最高OPG，为15 083个/g。说明羔羊对球虫易感性更高，这与前人研究结果相一致[11-13]。

表3 不同年龄段山羊球虫感染的OPG统计结果

2.3 球虫的种类鉴定

2.3.1 山羊艾美耳球虫种类 对不同年龄的山羊粪便分别用饱和食盐水漂浮法分离纯化卵囊，然后进行孢子化培养60 h。通过形态学鉴定(表4)共检测出7种球虫，分别为柯氏艾美耳球虫(E.christenseni)、阿氏艾美耳球虫(E.arloingi)、雅氏艾美耳球虫(E.ninakohlyakimovae)、艾丽艾美耳球虫(E.alijeri)、小型艾美耳球虫(E.parva)、家山羊艾美耳球虫(E.hirci)、山羊艾美耳球虫(E.caprina)(图1)。

表4 莎能奶山羊感染球虫的种类及形态学特征

a. 极帽；b. 卵膜孔；c. 极粒； d. 孢子囊；e. 斯氏体；A. 柯氏艾美耳球虫；B. 阿氏艾美耳球虫；C. 雅氏艾美耳球虫；D. 艾丽艾美耳球虫；E. 小型艾美耳球虫；F. 家山羊艾美耳球虫; G. 山羊艾美耳球虫

2.3.2 优势虫种统计分析 对随机提取的277个孢子化球虫卵囊进行优势虫种统计分析，其中，雅氏艾美耳球虫(E.ninakohlyakimovae)、阿氏艾美耳球虫(E.arloingi)和柯氏艾美耳球虫(E.christenseni)占比最高，依次为17.3%(48/277)，15.9%(44/277)和15.2%(42/277)，是该羊场的优势虫种。

3 讨 论

目前国内外公认的山羊球虫主要有9种[1]，在临床上常为混合感染。在9种球虫中，阿氏艾美耳球虫(E.arloingi)、柯氏艾美耳球虫(E.christenseni)、艾丽艾美耳球虫(E.alijeri)和雅氏艾美耳球虫(E.ninakohlyakimovae)已被公认为是致病性最强的4种山羊球虫[14-15]。目前，雅氏艾美耳球虫(E.ninakohlyakimovae)和阿氏艾美耳球虫(E.arloingi)是许多国家/地区山羊球虫的优势虫种，包括荷兰、捷克、马来西亚、波兰、南非、斯里兰卡、伊拉克、约旦、土耳其、伊朗、肯尼亚、津巴布韦和坦桑尼亚[14,16]。本试验通过饱和食盐水漂浮法对球虫卵囊进行分离[9,17]、形态学鉴定[10-11]，发现该羊场混合感染柯氏艾美耳球虫(E.christenseni)、阿氏艾美耳球虫(E.arloingi)、雅氏艾美耳球虫(E.ninakohlyakimovae)、艾丽艾美耳球虫(E.alijeri)、小型艾美耳球虫(E.parva)、家山羊艾美耳球虫(E.hirci)、山羊艾美耳球虫(E.caprina)。且该羊场雅氏艾美耳球虫(17.3%, 48/277)、阿氏艾美耳球虫 (15.9%, 44/277)和柯氏艾美耳球虫(15.2%, 42/277)为优势虫种。卵形指数分别为1.20、 1.50、1.47，与文献报道一致[14-15,18-19]。

研究结果表明，该羊场各年龄段的山羊普遍存在球虫感染。其中3～5月龄山羊和6～12月龄山羊感染率最高，达100%(27/27)。2月龄山羊感染率为95.5%(21/22)。该山羊场球虫平均感染率达98%。比贺圣杰等[18]在杨凌的统计结果(95.2%)高，可能与该羊场的防控力度较弱有关。也比常艳凯等[20]在西藏的调查统计结果(81.2%)高，可能因为陕西关中属盆地平原型地形，温度高于西藏高原山地，气候更适于卵囊快速发育[21-22]。

本研究中3～5月龄羔羊球虫平均OPG最高，为2 442个/g，6～12月龄山羊球虫平均OPG最低，为369个/g。但2月羔羊中检出最高的OPG，为15 083个/g。此次调查结果表明山羊月龄越小，球虫感染率相对越高，这与陶立等[23]、林琳等[24]的报道一致。

综上所述，虽然该羊场球虫感染较为普遍，但临床表现多为隐形感染，仅有少数羊只出现腹泻症状，导致该场在养殖中常忽视球虫防控。本次对球虫种类的分离与鉴定，阐明该羊场球虫种类分布和优势种，也明确了流行于该场羊只中致病性较高的球虫种类，从而有针对性地对病羊进行诊治。因此应加强对羊群的饲养管理、改善饲养条件，采用抗球虫药物对圈舍羊群进行预防性驱虫，定期对圈舍进行清洁消毒，保持圈舍干燥。保证饲草饲料、饮水的卫生，避免污染。对于已发病的羊只应及时隔离消毒，及时清理其排泄物、分泌物，防止交叉感染[21-22, 25-26]。