过表达和敲减ame-miR-13b对意大利蜜蜂幼虫肠道内基因表达的影响

祝智威, 王 杰, 隆 琦, 许雅静, 冯睿蓉, 刘佳美, 赵浩东,朱乐冉， 侯海青, 陈大福,2,*, 郭 睿,2,*

(1.福建农林大学动物科学学院(蜂学学院), 福州 350002; 2.福建农林大学蜂疗研究所, 福州 350002)

真核生物的基因组可转录形成大量的非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)，其中微小RNA(microRNA, miRNA)是一种长度约为18～25 nt的内源性小RNA(small RNA, sRNA)，能通过结合靶mRNA的3′UTR致其降解或抑制其翻译过程，从而在转录后水平发挥重要的调控作用(Fabianetal., 2010)。自从Lee等(1993)首次在秀丽隐杆线虫Caenorhabditiselegans发现第1个miRNAlin-4，并揭示lin-4能够调控秀丽隐杆线虫的发育过程以来，人们在小鼠Musmusculus、拟南芥Arabidopsisthaliana、家蚕Bombyxmori和蜜蜂球囊菌Ascosphaeraapis等动植物和微生物中鉴定到大量miRNA(Tripathietal., 2019; Wangetal., 2019; Chenetal., 2020; 陈华枝等, 2020)。有研究表明动物体内约有50%的基因受到miRNA的调控(Kroletal., 2010)。目前，miRBase数据库(http:∥www.mirbase.org/)中已收录200多个物种的近40 000个miRNA信息，含31种昆虫的3 000余个miRNA，包括西方蜜蜂Apismellifera的262个miRNA、黑腹果蝇Drosophilamelanogaster的469个miRNA、家蚕的563个miRNA、埃及伊蚊Aedesaegypti的164个miRNA、小菜蛾Plutellaxylostella的127个miRNA等。研究表明昆虫miRNA通过调控靶基因表达影响生长、发育、生殖、免疫及耐药性等重要生物学过程(杨婕等, 2021)。

目前，人们主要通过饲喂或注射相应的模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)对昆虫miRNA进行功能研究(Michelyetal., 2017)。前人通过过表达和敲减对蜜蜂的miRNA进行了一些功能研究，例如: Freitas等(2017)研究发现miR-34-5p能通过靶向调控西方蜜蜂体节分化基因eve,h和ftz-f1及结构基因act5C进而影响蜜蜂的胚胎发育；Michely等(2017)证实miR-12和miR-124可参与西方蜜蜂工蜂早期记忆的形成；Cristino等(2014)研究发现miR-932靶向调控西方蜜蜂的肌动蛋白基因，进而参与神经元的可塑性形成，并影响西方蜜蜂长期记忆的形成；Liu等(2017)发现ame-miR-279a在意大利蜜蜂Apismelliferaligustica哺育蜂和采集蜂头部中显著差异表达，通过靶向抑制Mblk-1的表达降低采集蜂对蔗糖的伸吻反应；Zhu等(2017)研究发现西方蜜蜂幼虫能够摄取植物花粉来源的miR-162a，并靶向抑制自身发育相关的amTOR基因的表达，进而诱导幼虫趋向工蜂的性状发育。此外，前人利用二代组学技术对西方蜜蜂miRNA进行了较多研究，例如，Zondag等(2012)利用RNA-seq结合原位杂交对西方蜜蜂早期胚胎形成过程中的miRNA表达进行分析，并通过敲减Dicer基因证明了miRNA参与了西方蜜蜂的胚胎形成。刘芳(2012)通过Solexa测序对西方蜜蜂的哺育蜂和采集蜂头部miRNA进行表达差异分析，发现9种miRNA在这两种不同职能的蜜蜂中差异表达。Chen等(2019)发现部分中华蜜蜂Apisceranaeceranae的miRNA在受到东方蜜蜂微孢子虫Nosemaceranae侵染后发生差异表达，功能注释表明miRNA调控宿主被侵染后的能量代谢以及免疫通路。

蜜蜂作为完全变态昆虫，其幼虫生长以及化蛹过程受到保幼激素和蜕皮激素的共同调控，其中蜕皮激素受体(ecdysone receptor, EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle, USP)形成的异源二聚体在调控昆虫蜕皮过程中发挥关键作用(Chen and Fu, 2021)。表皮生长因子(epidermal growth factor, Egfr)广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物，可参与器官发育、机体生长及生殖等生物学过程(王菲等, 2017)。细胞色素P450作为一种重要的氧化代谢酶，在昆虫中参与内源物质代谢并发挥解毒等重要功能(Ohkawaetal., 1998; 王洋等, 2019)。miR-13b作为miR-2家族的主要成员，已被证实可通过调节P450参与淡色库蚊Culexpipienspallens的溴氰菊酯抗性(Guoetal., 2017)、东亚飞蝗Locustamigratoria的卵子形成(Songetal., 2019)以及德国小蠊Blattellagermanica的变态发育(Lozanoetal., 2015)等过程。意大利蜜蜂miR-2家族包括6个成员，分别是ame-miR-2-1, ame-miR-2-2, ame-miR-2-3, ame-miR-13a, ame-miR-13b和ame-miR-2b，这6个成员形成基因簇并位于1号染色体蛋白编码基因的内含子区域(Heetal., 2008)。笔者团队前期利用sRNA-seq技术对意大利蜜蜂4, 5和6日龄幼虫肠道进行测序，通过比较分析揭示肠道发育过程中miRNA与Wnt, Hippo, FoxO和Hedgehog信号通路及蜕皮激素相关靶mRNA之间具有潜在的复杂调控关系(熊翠玲等, 2018)；进一步分析发现ame-miR-13b在意大利蜜蜂4, 5和6日龄幼虫肠道中的表达量持续增加(TPM值分别为: 2 235.31, 2 832.86和3 003.52)，暗示其在肠道发育中具有潜在作用；另外，软件预测结果显示ame-miR-13b与Ecr,Egfr和P45018a1等基因之间存在靶向结合关系(郭睿等, 2018)。蜜蜂幼虫肠道是消化吸收和免疫防御的关键器官，但ame-miR-13b调控意大利蜜蜂幼虫肠道发育的研究迄今仍然缺失。

本研究根据ame-miR-13b的核酸序列合成相应的mimic和inhibitor，尝试通过饲喂法对意大利蜜蜂幼虫肠道中的ame-miR-13b进行过表达和敲减，进而检测过表达和敲减ame-miR-13b对其3个靶基因Ecr,Egfr和P45018a1表达的影响。研究结果可为深入探究ame-miR-13b调控意大利蜜蜂幼虫肠道发育的分子机理提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 供试生物材料

本研究使用的意大利蜜蜂工蜂幼虫取自福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)教学蜂场。按照笔者团队前期建立的技术流程(郭睿等, 2018, 2019)进行意大利蜜蜂幼虫的人工饲养及肠道样品的制备：(1)选取外观健康且群势较强的意大利蜜蜂蜂群，利用蜂王产卵控制器将蜂王限制于空脾上，自然产卵12 h后取出蜂王，然后迅速将上述巢脾提至实验室，利用移虫针将发育至2日龄的幼虫小心移至已预制50 μL饲料(蜂王浆50%，葡萄糖6%，果糖6%，酵母粉1%，无菌水37%)的48孔细胞培养板，置于恒温恒湿箱，在35±0.5℃和相对湿度(RH)90%的条件下饲养。(2)预先配制分别含mimic-ame-miR-13b和inhibitor-ame-miR-13b的饲料50 μL(终浓度均为2 500 fmol/g)，饲喂意大利蜜蜂3日龄幼虫，每12 h更换一次饲料，连续饲喂6次，饲养幼虫至6日龄。同时，用含mimic-NC(无义mimic)或inhibitor-NC(无义inhibitor)的饲料50 μL(终浓度均为2 500 fmol/g)，饲喂意大利蜜蜂3日龄幼虫，每12 h更换一次饲料，连续饲喂6次，作为对照组。每3头作为一个生物学重复，共3次生物学重复。(3)在超净台中用无菌的眼科剪和眼科镊分别剖取意大利蜜蜂4, 5和6日龄幼虫肠道(分别为Am4, Am5和Am6)，每3头幼虫的肠道样品置于一个RNA-Free EP管，经液氮速冻后立即转移到-80℃超低温冰箱保存备用。参照Zhu等(2017)设计mimic-ame-miR-13b, inhibitor-ame-miR-13b, mimic-NC和inhibitor-NC序列，委托上海吉玛制药技术有限公司合成，序列信息见表1。

表1 ame-miR-13b的模拟物和抑制物及相应对照序列Table 1 Sequences of mimic and inhibitor of ame-miR-13b and their counterpart controls

1.2 ame-miR-13b的过表达和敲减效果检测

根据ame-miR-13b的核苷酸序列，参照郭睿等(2019)方法设计特异性的Stem-loop引物和正向引物及通用的反向引物 (表2)， 委托上海生物工程公司进行合成。利用RNA抽提试剂盒(Promega，美国)分别提取上述1.1节的Am4, Am5和Am6样品的总RNA，将其均分为两份，其中一份RNA按照反转录试剂盒(诺唯赞，南京)说明书的步骤利用Stem-loop引物进行反转录，得到的cDNA作为模板进行ame-miR-13b的RT-qPCR；另一份RNA利用Oligo dT引物进行常规反转录，得到的cDNA作为模板进行ame-miR-13b靶基因、内参基因18S rRNA(GenBank登录号: U89834.1)和内参基因actin(Gene ID: AB023025.1)的RT-qPCR。

表2 引物信息Table 2 Primer information

参照SYBR Green试剂盒(诺唯赞，南京)的说明书，在ABI QuantStudio 3荧光定量PCR系统(ABI公司，美国)上进行ame-miR-13b的RT-qPCR反应，反应体系: SYBR Green Dye(诺唯赞，南京)10 μL, 上下游引物ame-miR-13b-F/R (2 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, DEPC水7 μL。反应条件: 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 59℃ 30 s, 40个循环；熔解曲线程序默认系统设置。内参基因为18S rRNA(GenBank登录号： U89834.1),每个反应均进行3个平行重复和3次技术重复。

1.3 ame-miR-13b的靶基因表达量的RT-qPCR检测

笔者所在团队前期已利用基于链特异性建库的sRNA-seq技术对意大利蜜蜂4, 5和6日龄幼虫肠道进行测序，获得了高质量的转录组数据(郭睿等, 2018; 熊翠玲等, 2018)。 联用RNAhybrid, miRanda和TargetScan软件预测ame-miR-13b的靶基因，采用软件默认参数，靶向分析结果显示ame-miR-13b可靶向结合Ecr(GenBank登录号: 406084),Egfr(GenBank登录号: 100577393)和P45018a1(GenBank登录号: 410405)基因(未发表数据)。根据ame-miR-13b与上述3个靶基因之间的靶向结合关系，通过Adobe Photoshop CS6软件绘制ame-miR-13b与靶基因3′UTR种子区域的碱基互补配对关系示意图。将1.2节中利用Oligo dT引物进行常规反转录得到的6日龄幼虫肠道cDNA作为模板，利用qPCR检测上述3个靶基因的相对表达量。反应体系: SYBR Green Dye 10 μL, 上下游引物(2 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, DEPC水7 μL。反应条件: 5℃ 5 min; 95℃ 10 s, 59℃ 30 s, 40个循环。以actin(Gene ID: AB023025.1)作为内参基因。每个反应均进行3次平行重复和3次技术重复。

1.4 数据分析

采用2-ΔΔCt法进行基因表达的相对定量。利用GraphPad Prism 7软件进行数据分析并绘图，数据进行Student氏t检验。

2 结果

2.1 意大利蜜蜂幼虫肠道内ame-miR-13b的过表达和敲减效果

RT-qPCR检测结果显示，相较于mimic-NC饲喂组，mimic-ame-miR-13b饲喂组中意大利蜜蜂4, 5和6日龄幼虫肠道内ame-miR-13b均上调表达，且在4(P=0.0042)和6(P=0.000012)日龄幼虫肠道内显著上调，说明过表达效果显著(图1: A, C)；相较于inhibitor-NC饲喂组，饲喂inhibitor-ame-miR-13b组中5(P=0.0187)和6(P=0.0000069)日龄幼虫肠道内ame-miR-13b显著下调，说明敲减效果显著(图1: E, F)；相较于mimic-ame-miR-13b饲喂组，inhibitor-ame-miR-13b饲喂组中4(P=0.0002), 5(P=0.0375)和6(P=0.00000026) 日龄幼虫肠道内ame-miR-13b 均显著下调表达 (图1: G, H, I)；相较于mimic-NC饲喂组，inhibitor-NC饲喂组中4(P=0.3445), 5(P=0.8677)和6(P=0.0646)日龄幼虫肠道内ame-miR-13b均为下调表达，但差异均不显著(图1: J-L)。

图1 过表达和敲减ame-miR-13b后其在意大利蜜蜂4 (A, D, G, J), 5 (B, E, H, K)和6 (C, F, I, L)日龄幼虫肠道中的表达量Fig.1 Expression levels of ame-miR-13b in the gut of the 4- (A, D, G, J), 5- (B, E, H, K) and 6-day-old (C, F, I, L)larvae of Apis mellifera ligustica after overexpression and knockdown of ame-miR-13b参照Zhu等(2017)法设计合成ame-miR-13b的模拟物mimic-ame-miR-13b和抑制剂inhibitor-ame-miR-13b及其对照mimic-NC和inhibitor-NC序列，与饲料混合后饲喂意大利蜜蜂3日龄幼虫，以2 500 fmol/g的终浓度每间隔12 h饲喂1次，并连续饲喂6次。图中数据为平均值±标准误；柱上符号表示两组间差异显著性(ns P>0.05; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001)(Student氏t检验)；下同。The sequences of mimic-ame-miR-13b and inhibitor-ame-miR-13b and their counterpart controls mimic-NC and inhibitor-NC were designed and synthesized as reported in Zhu et al.(2017), and then mixed with the diet at a final concentration of 2 500 fmol/g to feed the 3-day-old larvae of A. m. ligustica, the diet was changed every 12 h and the larvae were fed 6 times.Data in the figure are mean±SE.Symbols above bars indicate significant difference between two groups (ns P>0.05; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; ****P<0.0001)(Student’s t-test).The same below.

2.2 过表达和敲减ame-miR-13b后意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道内靶基因的表达量

ame-miR-13b与靶基因Ecr,Egfr和P45018a1基因的3′UTR种子区域的碱基互补配对关系如图2所示。

图2 Ecr(A), Egfr(B)和P450 18a1基因(C)与ame-miR-13b之间的靶向结合关系Fig.2 Targeted binding relationship between Ecr (A), Egfr (B) and P450 18a1 (C) and ame-miR-13b

RT-qPCR结果显示，相较于mimic-NC饲喂组，mimic-ame-miR-13b饲喂组中6日龄幼虫肠道内Ecr表达量显著升高(P=0.0267)(图3: A)；Egfr的表达量显著降低(P=0.0483)(图3: B)；P45018a1的表达量显著升高(P=0.0267)(图3: C)。

图3 过表达ame-miR-13b后靶基因Ecr (A), Egfr(B)和P450 18a1(C)在意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中的表达量Fig.3 Expression levels of target genes Ecr (A), Egfr (B) and P450 18a1 (C) of ame-miR-13b in the gutof the 6-day-old larvae of Apis mellifera ligustica after overexpression of ame-miR-13b

与inhibitor-NC饲喂组相比，inhibitor-ame-miR-13b饲喂组中6日龄幼虫肠道内Ecr也显著上调表达(P=0.0006)(图4: A)；Egfr的表达量升高，但差异不显著(P=0.1940)(图4: B)；P45018a1的表达量显著下降(P=0.0006)(图4: C)。

图4 敲减ame-miR-13b后靶基因Ecr (A), Egfr(B)和P450 18a1(C)在意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中的表达量Fig.4 Expression levels of target genes Ecr (A), Egfr (B) and P450 18a1 (C) of ame-miR-13b in the gut ofthe 6-day-old larvae of Apis mellifera ligustica after knockdown of ame-miR-13b

与mimic-ame-miR-13b饲喂组相比，inhibitor-ame-miR-13b饲喂组中6日龄幼虫肠道内Ecr的表达量降低，但差异不显著(P=0.1049)(图5: A)；Egfr的表达量升高，但差异不显著(P=0.0528)(图5: B)；P45018a1的表达量显著下调(P=0.0001)(图5: C)。上述结果显示，P45018a1的表达与ame-miR-13b之间存在潜在正相关关系。

图5 过表达和敲减ame-miR-13b后靶基因Ecr (A), Egfr (B)和P450 18a1(C)在意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中的表达量Fig.5 Expression levels of target genes Ecr (A), Egfr (B) and P450 18a1 (C) of ame-miR-13b in the gut ofthe 6-day-old larvae of Apis mellifera ligustica after overexpression and knockdown of ame-miR-13b

3 讨论

本研究中，我们参照前人的方法(Zhuetal., 2017)设计合成了ame-miR-13b的模拟物mimic-ame-miR-13b和抑制物inhibitor-ame-miR-13b序列，与饲料混合后对意大利蜜蜂幼虫进行饲喂，以2 500 fmol/g的终浓度每间隔12 h饲喂1次，并连续饲喂6次。RT-qPCR结果显示，饲喂mimic-ame-miR-13b后ame-miR-13b在意大利蜜蜂4, 5和6日龄幼虫肠道中均上调，在6日龄幼虫肠道中上调幅度最大(2.33倍)且差异显著性最高(P=0.000012)；饲喂inhibitor-ame-miR-13b后ame-miR-13b在4日龄幼虫肠道中下调表达，在5和6日龄幼虫肠道中均显著下调表达(图1)。以上结果表明通过饲喂法在蜜蜂幼虫个体水平进行miRNA的过表达和敲减具有充分的可行性，且过表达和敲减效果具有累积效应。这为日后在蜜蜂幼虫个体水平进行miRNA的过表达和敲减提供了实验依据。此前，通过注射mimic和inhibitor对成年蜜蜂进行miRNA的过表达和敲减已有一些报道(Freitasetal., 2017; Michelyetal., 2017)。本研究之所以选择通过饲喂法对意大利蜜蜂幼虫进行ame-miR-13b的过表达和敲减，是因为幼虫较为脆弱，注射导致的机械损伤极易造成幼虫死亡。

笔者所在团队前期研究发现ame-miR-13b可潜在靶向结合Ecr,Egfr和P45018a1等850个基因。Ecr编码蜕皮激素受体，蜕皮激素与保幼激素通过协同作用影响昆虫蜕皮以及变态发育过程(Chen and Fu, 2021)。Egfr编码的表皮生长因子是广泛存在于后生动物中的多功能受体，参与机体生长和生殖、创口修复等一系列重要的生理过程(王菲等, 2017)。P450编码的细胞色素P450加单氧酶是昆虫体内三大解毒酶家族之一，对昆虫生长发育及抗性起着关键作用(Ohkawaetal., 1998; 王洋等, 2019)。较多的研究表明miRNA对其靶基因表达发挥负调控作用(von Bornetal., 2018; Samadetal., 2019; Chenetal., 2020)。本研究中，过表达ame-miR-13b后，意大利蜜蜂6日龄幼虫肠道中Egfr显著下调表达(图3： B)，敲减ame-miR-13b后Egfr上调表达但不显著(图4: B)，表明ame-miR-13b与Egfr之间具有潜在的负调控关系。这表明意大利蜜蜂幼虫可能通过上调ame-miR-13b的表达水平负调控Egfr的表达进而影响肠道发育过程。然而，Egfr在inhibitor-NCvsinhibitor-ame-miR-13b比较组中虽然表达量升高但不具有显著性，推测这可能与饲喂的mimic和inhibitor剂量较低有关。下一步将以2 500 fmol/g浓度为基准，设置梯度浓度的ame-miR-13b的mimic和inhibitor对意大利蜜蜂幼虫进行饲喂，进一步确定mimic和inhibitor的最佳浓度。另外，过表达ame-miR-13b后Ecr表达量显著升高(图3: A)，敲减ame-miR-13b后Ecr同样显著上调表达(图4: A)，ame-miR-13b与Ecr之间没有明显的正向或负向调控关系，说明该基因的表达还受到其他因素的调节。与mimic-NC组相比，P45018a1在mimic-ame-miR-13b组的表达量显著上升(图3: C)；而与inhibitor-NC组相比，P45018a1在inhibitor-ame-miR-13b组的表达量显著下降(图4: C)，说明ame-miR-13b与P45018a1之间并无负调控关系。鉴于目前已有少量研究报道miRNA也能够对靶基因表达进行正调控(Ørometal., 2008; Pandaetal., 2014)，ame-miR-13b与P45018a1之间如何互作及影响意大利蜜蜂幼虫肠道发育值得进一步深入研究。

综上，本研究通过饲喂mimic-ame-miR-13b和inhibitor-ame-miR-13b的方法成功在意大利蜜蜂幼虫体内实现了ame-miR-13b的过表达及敲减，并揭示ame-miR-13b与Egfr之间存在潜在的负调控关系。研究结果为进一步探究ame-miR-13b调控意大利蜜蜂幼虫肠道发育的分子机理提供了理论和实验依据。