NaCl胁迫下壳聚糖影响菜用大豆结瘤固氮的研究

2022-05-19宋明月孙继鑫代重阳王振军

内蒙古民族大学学报(自然科学版) 2022年2期

孟飞，宋明月，孙继鑫，代重阳，王振军，王聪

（1.内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽 028043；2.内蒙古伊品生物科技有限公司，内蒙古赤峰 024076；3.兴安盟农牧技术推广中心，内蒙古乌兰浩特 137400）

豆科植物和根瘤菌的共生系统可以把空气中的氮元素固定成氨元素，固定氮素的同时还能为寄主植物提供大量氮肥［1］。在豆科植物的生长过程中，根瘤的共生固氮为其提供重要的氮源，对于提高豆科植物的质量和产量起着十分重要的作用［2］。同时，它不仅可以减少因为化学氮肥的大量使用对土壤结构造成的破坏和水污染，而且可以改善土壤，增加土壤肥力，有利于可持续农业的发展。然而，豆科植物的生物固氮效率受逆境因素的影响，尤其环境胁迫，不仅对于豆科植物根瘤的形成、发育有很大的影响，同时还影响根瘤的固氮效率［3］。周婵婵等［4］研究发现，盐胁迫对水稻的产量、品质及其农艺性状均有十分严重的影响。张威等［5］研究表明，盐胁迫可显著抑制大豆的根瘤数，盐胁迫对于菜用大豆的结瘤和固氮均有严重影响。而且大豆根瘤在形成初期对盐胁迫十分敏感。喻定文等［6］研究结果表明，在NaCl处理下，植株催化大气中氮转变成氨的固氮酶活性下降，致使酶活性受到显著抑制。

壳聚糖（CTS）是甲壳素脱乙酰化后得到的聚氨基葡萄糖。它是一种非常廉价和清洁的化学物质，对植物抗逆能力的增强有显著的促进作用。刘桂智［7］研究发现，壳聚糖对日光温室内黄瓜的株高、鲜重等指标有显著增强作用；而盛玮等［8］则发现，壳聚糖能显著缓解NaCl胁迫下小麦种子的萌发和小麦幼苗的生长，徐芬芬等［9］研究结果表明，100 mg·L-1的CTS作为诱抗剂，可明显改善盐胁迫下小白菜的多种生理指标，提高小白菜的抗氧化能力，并且提高膜稳定性进而减轻盐害。宋士清等［10］研究发现，外源壳聚糖能有效减轻黄瓜幼苗的受伤害程度，促进植物生长发育。目前，壳聚糖对盐胁迫下豆科植物结瘤固氮作用的研究报道较少。

土壤盐碱化是目前全球关注的最重要的问题之一。我国的盐渍化情况比较严重。到目前为止，中国现有的盐碱土地总面积已超过9 000万hm2。而土壤又因受到很多因素的影响，致使土壤盐渍化和次生盐渍化不断加剧［11-12］，这种环境条件严重威胁着农作物的生产和生态环境建设，不利于植物的可持续发展。目前，大多数广泛种植的作物品种均对NaCl胁迫敏感甚至高度敏感，植株耐盐性普遍较低［13］。在目前的植物生产过程中，十分迫切地需要一种清洁、廉价并且环保可行的方法来维持NaCl胁迫下豆科植物与根瘤菌之间良好的共生关系，同时维持好这种良好的共生关系对于豆科植物提高耐盐性也有一定的帮助。本研究以不同盐敏感度的菜用大豆为试材，研究外源壳聚糖对于NaCl胁迫下的菜用大豆结瘤和固氮的影响，目的在于为缓解豆科植物的盐分障碍提供新的理论与方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

菜用大豆品种选用不同盐敏感度的品种，分别为盐敏感品种“日本青”与耐盐品种“绿领八号”。“日本青”接种与其共生匹配性较好的快生型根瘤菌HH103，“绿领八号”接种与其共生匹配性较好的慢生根瘤菌USDA122［14］（均购买于黑龙江省农科院微生物研究所）。

1.2 试验方法

1.2.1 试材培育挑选生长状况一致的种子，在95%乙醇冲洗30 s后，再用次氯溶液消毒，捞出后用无菌水冲洗2遍，随后播入上口径25 cm、下口径10 cm、高15 cm、底部有小孔的硬质塑料钵中。每钵播2粒种子，定苗1株。放入人工气候箱中培养，昼夜温度保持在18～25℃。

1.2.2 试验处理设5个壳聚糖（CTS）浓度处理：100、150、200、250、300 mg·L-1，以蒸馏水作为空白对照1（CK1），50 mmol·L-1的NaCl溶液（预备试验筛选，在此浓度下，菜用大豆能够生长，同时能够形成根瘤）胁迫作为对照2（CK2）。待菜用大豆幼苗的2片真叶完全展开后，在大豆幼苗的叶片上均匀喷洒壳聚糖无菌水溶液，以量足但不下滴为宜，对照喷洒无菌水。于壳聚糖诱导处理的5 d后，将溶有NaCl的无氮营养液均匀地浇入基质中，CK1仅浇无氮营养液。每处理12株，3次重复，各植株完全随机排列。

1.2.3 菌悬液制备将活化后的根瘤菌接种到培养基中，然后于黑暗中振荡培养得到菌悬液。菌悬液制备后通过分光光度计测定其吸光值来确定根瘤菌的活菌数。

1.2.4 接种 NaCl处理后随即当天接种。将根瘤菌悬浮液稀释并测定其吸光值至OD600值0.1，每株大豆秧苗的根部喷注摇匀的菌悬液1 mL后，每棵植株根部覆盖同样厚度的蛭石。放入人工气候箱中培养。包括蛭石在内的所有实验用具在使用前均进行20 min的高压灭菌。

1.3 指标测定

在接种30 d后，从塑料钵中完整地取出菜豆植株，不破坏其根系。于清水中缓慢反复冲洗蛭石且不损害根瘤，取根瘤时数根瘤数并测根瘤鲜重，取完根瘤后立即测定根瘤固氮酶活性，根瘤豆血红蛋白含量、根瘤类菌体NH3含量、根瘤细胞浆NH3含量及根系活力，最后将植株烘干，测定各处理的植株干重和植株地上、地下部的含氮量。

采用刘文钰等［15］的乙炔还原法对根瘤的固氮酶活性进行测定；参考WANG等［16］的方法对根瘤豆血红蛋白含量进行测定；参考李慧等［17］的方法对根瘤的类菌体NH3含量和细胞浆NH3含量进行测定；参考凯氏定氮法［18］测定植株地上、地下部的含氮量；根系活力的测定参考朱秀云等［19］的方法进行测定。

1.4 数据分析

使用SPSS、Excel软件进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆植株生长的影响

NaCl胁迫下（CK2）2个品种菜用大豆的地上部、地下部生物量较对照（CK1）均显著下降，降幅分别为28%、44%和25%、42%。而CTS处理后，对2个品种地上部、地下部生物量均产生了不同程度的影响，其中，“日本青”地上部、地下部生物量在150、200、250 mg·L-1浓度下较CK2均显著升高，增幅分别为10%、21%、10%和35%、48%、32%，其余浓度下未见显著影响；“绿领八号”地上部、地下部生物量在100、150、200、250 mg·L-1浓度下均较CK2显著升高，增幅分别为12%、12%、24%、9%和27%、36%、55%、30%，此外，其地下部生物量在300 mg·L-1处理下较CK2也显著升高24%（表1）。上述结果显示，一定浓度CTS处理能显著缓解菜用大豆的盐胁迫伤害，且200 mg·L-1的CTS表现出较强的缓解效应；而相对于地上部，CTS对地下部的缓解作用较强。与“日本青”相比，200 mg·L-1CTS对“绿领八号”地上部、地下部生物量均表现出了较强的缓解效应，说明适宜CTS浓度下，耐盐品种具有较强的诱导潜力。

表1 NaCl胁迫下壳聚糖对菜用大豆生物量的影响Tab.1 Effects of chitosan on biomass of vegetable soybean under NaCl stress

2.2 壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆结瘤固氮的影响

2个品种菜用大豆的根瘤数，根瘤鲜重，地上部、地下部植株含氮量在NaCl胁迫下（CK2）受到了显著抑制，而CTS处理后对2个品种各指标均产生了不同程度的促进作用，其中，“日本青”根瘤数和根瘤鲜重在150、200、250 mg·L-1浓度下较CK2均显著升高，增幅分别为31%、39%、34%和18%、46%、21%；100 mg·L-1CTS处理下地下部植株含氮量较CK2显著升高9%，150、200、250 mg·L-1CTS下地上部、地下部植株含氮量均较CK2显著升高，其增幅分别为8%、14%、9%和17%、29%、12%。“绿领八号”在100 mg·L-1CTS处理下其根瘤鲜重较CK2显著升高16%，在150、200、250、300 mg·L-1下其根瘤数、根瘤鲜重较CK2均显著升高，增幅分别为33%、57%、41%、24%和16%、50%、22%、19%；地上部、地下部植株含氮量在100、150、200 mg·L-1CTS浓度下较CK2的增幅分别为7%、9%、15%和12%、13%、30%，此外，地上部植株含氮量在250 mg·L-1CTS处理下较CK2显著升高8%（表2）。上述结果表明，一定浓度CTS处理能显著缓解盐胁迫对菜用大豆结瘤固氮的阻遏作用，且200 mg·L-1CTS浓度表现出较强的缓解效应。与“日本青”相比，200 mg·L-1CTS对“绿领八号”的结瘤固氮具有较强的促进作用。

表2 壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆的结瘤固氮的影响Tab.2 Effects of chitosan on nodulation and nitrogen fixation of vegetable soybean under NaCl stress

2.3 壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性的影响

NaCl胁迫下（CK2）导致2个品种菜用大豆的根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性大幅下降，降幅分别达34%、37%和33%、34%，而CTS处理后对2个品种根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性均产生了不同程度的诱导作用，其中，“日本青”根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性在150、200、250、300 mg·L-1CTS浓度下均较CK2显著升高，增幅分别为19%、33%、17%、23%和23%、35%、23%、20%；“绿领八号”在150、200、250 mg·L-1CTS浓度下的增幅分别达25%、33%、25%和24%、37%、26%（表3）。表明NaCl胁迫下一定浓度外源CTS能显著促进菜用大豆根瘤中血红蛋白的合成并且提高固氮酶活性，且200 mg·L-1CTS的作用较强。与“日本青”相比，200 mg·L-1CTS对“绿领八号”根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性有较强的诱导作用。

表3 NaCl胁迫下壳聚糖对菜用大豆的根瘤豆血红蛋白含量和固氮酶活性的影响Tab.3 Effects of chitosan on hemoglobin content and nitrogenase activity in rhizobium of vegetable soybean under NaCl stress

续表3

2.4 壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆根系活力的影响

NaCl胁迫（CK2）对2个品种菜用大豆的根系活力产生了显著的抑制作用，而CTS处理使其根系活力均有不同程度的回升，其中，“日本青”在100、150、200 mg·L-1浓度下较CK2的增幅分别为13%、16%、32%；“绿领八号”在150、200、250 mg·L-1浓度下较CK2的增幅分别为17%、32%、18%（图1）。表明外源CTS能缓解盐胁迫对菜用大豆根系造成的伤害，且200 mg·L-1的CTS具有较强的缓解效应。

图1 NaCl胁迫下壳聚糖对菜用大豆根系活力的影响Fig.1 Effects of chitosan on root activity of vegetable soybean under NaCl stress

2.5 壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆细胞中的氨含量（细胞浆）和类菌体的影响

NaCl胁迫下（CK2）对2个品种菜用大豆的根瘤类菌体产生了显著的抑制作用，而CTS处理使其根瘤类菌体有了不同程度的回升，其中，“日本青”在150、200、250、300 mg·L-1浓度下较CK2的增幅分别为22%、27%、18%、21%；“绿领八号”在200、250、300 mg·L-1浓度下较CK2的增幅分别为14%、8%、9%。NaCl胁迫下（CK2）使2个品种菜用大豆的根瘤细胞浆显著升高，而CTS处理使其根瘤细胞浆有了不同程度的降低，其中，“日本青”在200、250、300 mg·L-1浓度下较CK2的降幅分别为8%、7%、6%；“绿领八号”在150、200、250、300 mg·L-1浓度下较CK2的降幅分别为7%、9%、8%、9%（表4）。表明外源CTS能在盐胁迫下对菜用大豆根瘤中N2的还原及NH3的进一步转化产生显著的缓解效果。

表4 壳聚糖对NaCl胁迫下菜用大豆根瘤类菌体和细胞浆中氨含量的影响Tab.4 Effects of chitosan on ammonia content in rhizobia and cytoplasm of vegetable soybean under NaCl stress

续表4

3 讨论

试验表明，盐胁迫对于豆科植物的根瘤形成、发育以及植物地上、地下部的固氮效率均有显著的抑制作用。王聪等［20］研究表明，盐胁迫不仅显著抑制豆科植物-根瘤菌的共生体系，而且抑制根瘤菌的生长，大幅度降低根瘤菌的抗氧化能力，最终导致豆科植物的幼苗早期生长受抑制。在本试验中，2个菜用大豆品种的根瘤数量和鲜重在NaCl胁迫下显著下降，并显著降低了根系活力，抑制了植株的生长。壳聚糖处理后，盐胁迫下菜用大豆的结瘤数、根瘤鲜重、根系活力及植株生物量显著升高，说明壳聚糖（CTS）可以减轻NaCl胁迫对菜用大豆根系造成的伤害，并且通过改善菜用大豆根系的生长状况的方式，来改善地上部分植株的生长和营养状况。同时，壳聚糖可以减轻NaCl对根瘤菌造成的伤害，这可能是壳聚糖诱导盐胁迫下菜用大豆结瘤的重要原因之一。

现有研究表明，豆血红蛋白可以将O2转移到类菌体的铁血红蛋白中，从而有效地维持豆科植物根瘤内较低的O2，并且豆血红蛋白含量的高低反映了固氮酶活性的大小［21］，且另有DAKORA等［22］研究表明了植物的根瘤固氮酶活性随着豆血红蛋白含量的增加而增加。在本研究中，外源壳聚糖处理对于NaCl胁迫下的菜用大豆根瘤中豆血红蛋白含量与固氮酶活性均有显著的缓解抑制作用，说明外源壳聚糖处理具有提高根瘤中的豆血红蛋白含量的作用，从而满足大豆根瘤对于高流量、低氧环境的需求，进而提高菜用大豆的固氮酶活性，促使盐胁迫下的固氮作用能有效进行；外源壳聚糖显著提高了盐胁迫导致的菜用大豆根瘤豆血红蛋白含量的降低，从而提高根瘤固氮酶活性，进而升高根瘤类菌体中氨含量；同时，壳聚糖处理后显著降低了盐胁迫下2个品种菜用大豆根瘤细胞浆中NH3浓度，表明外源壳聚糖处理能促进NH3进一步向下转化，而NH3被转化的同时也促进了根瘤中固氮酶活性含量的增加。在大量的固氮酶作用下，根瘤类菌体中更多的N2还原为NH3，并迅速转移至细胞浆中，形成良性循环。NH3在GOGAT酶和GS酶的共同作用下转化为氨基酸，当根瘤细胞浆中NH3快速转化为氨基酸并且合成蛋白质时，才能促使固氮作用不断进行［23-24］。这可能是NaCl胁迫下CTS促进菜用大豆固氮的重要原因之一。

本研究发现，一定浓度的CTS处理能显著促进NaCl胁迫下菜用大豆的结瘤固氮作用，而200 mg·L-1CTS则表现出较强的诱导作用，说明200 mg·L-1是CTS促进盐胁迫下菜用大豆结瘤固氮的适宜浓度；与盐敏感品种“日本青”相比，200 mg·L-1CTS对耐盐品种“绿领八号”根瘤数、瘤重及根部固氮量均表现出了较强的促进作用，表明CTS对耐盐品种“绿领八号”结瘤固氮具有较强的诱导潜力。