抗菌肽重组表达的优化策略

宗西翠，张翼 综述，方彭华，陈玉清 审校

1.南京中医药大学翰林学院医学院实验实训中心，江苏 泰州 225300；2.南京师范大学生命科学学院 生物化学与生物制品研究所，江苏 南京 210034；3.南京中医药大学 第一临床医学院，江苏 南京 210023

抗菌肽是由特定基因编码并诱导产生的一类多肽，具有相对分子质量小、热稳定性高、作用机制独特、杀菌范围广等特点，同时在刺激伤口愈合、激素调节及免疫调节等方面有重要作用。当前耐药性问题日趋突出，对新型抗菌药物需求十分迫切，抗菌肽引起耐药的可能性较小，具有较好的应用及开发前景。

抗菌肽的生产方法主要有3 种：①利用化学方法从生物有机体内直接提取天然抗菌肽；②化学方法合成抗菌肽；③利用基因工程技术生产抗菌肽。生物体中抗菌肽类型丰富，但含量极低，且相对分子质量较小，分离纯化困难，因此直接从机体中提取天然抗菌肽的开发研究虽取得了一定进展，但尚无法进行规模化生产。根据已知氨基酸序列，利用化学合成法合成抗菌肽虽然起步较早，技术亦较为成熟，但由于提纯过程复杂、工作量大、产物消旋、侧链基团易被破坏、无法形成复杂空间结构等缺点，限制了其在大规模生产中的应用。随着基因工程技术的高速发展及其在工业化应用中的不断成熟，通过原核或真核表达系统大规模制备基因工程抗菌肽已成为可能，是大量获得抗菌肽最经济、科学、有效的途径，但由于表达量低、表达产物不稳定、与宿主之间的毒性作用等因素制约了其规模化生产。本文就抗菌肽重组表达过程中的融合标签选择、偏爱密码子选择、最适菌株选择、基因共表达、融合蛋白纯化方法及基因表达设计等方面的优化策略作一综述，以期为抗菌肽的应用和规模化生产提供参考。

1 融合标签的选择

利用大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）重组表达的抗菌肽，如拟穴青蟹抗菌肽［1］、PlnF 抗菌肽［2］、UBI18-35 抗菌肽［3］、GKY20 抗菌肽［4］等均以包涵体形式存在，后续处理较繁琐，且复性后目的蛋白可能丧失活性［5］。将不易被E.coli 蛋白酶降解的蛋白基因与抗菌肽基因相连接，再转入宿主菌中进行融合表达，可有效提高其抗菌活性、稳定性，并延长其在体内的半衰期。应用较多的融合表达系统包括β-半乳糖苷酶系统、谷胱甘肽转移酶（glutathione transferase，GST）系统、麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein，MBP）系统、纯化标签融合系统（如Flag-tag 和His-tag）、金黄色葡萄球菌蛋白A 系统及其他融合系统（如硫氧还蛋白）等，见表1［3，6-31］。

表1 近年已报道的抗菌肽重组表达系统Tab.1 Recombinant expression systems of antimicrobial peptides reported in recent years

硫氧还蛋白（thioredoxin，TrxA）和GST 是抗菌肽融合表达中最常用的两种载体蛋白，能够促进多肽在E.coli 细胞质中的可溶性表达。王若诚等［32］将鲎素抗菌肽目的基因Tachyplesin1（TP1）与TrxA 标签以可溶形式进行融合表达，重组蛋白TP1 对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）均具有良好抑菌活性，最小抑菌浓度分别为6 和10 mg ／ L。王文佳等［33］将蜂毒肽（melittin）插入载体pGEX6p-1，转入E.coli BL21（DE3）进行诱导表达，并使用GST 亲和层析纯化重组蛋白，结果显示，该重组蛋白具有明显抑菌和抗肿瘤的作用。但由于TrxA 相对分子质量较大（11 800），使标签在融合产物中占较大比例；GST 也易发生蛋白水解降解，导致低效生产。小泛素样修饰蛋白（small ubiquitin like modification protein，SUMO）是一种新的融合载体，可提高靶蛋白折叠率和溶解性，SUMO特异性蛋白酶的存在有利于运载蛋白的释放。WU等［34］将melittin 与LL37 结合，设计杂交多肽melittin（1-13）-LL37（17-30）（M-L），并克隆至载体pET-SUMO，于E.coli 中表达，得到约165 mg ／ L 可溶性融合蛋白SUMO-M-L（纯度92%），M-L 对所有指示菌（尤其是革兰阳性菌）的抗菌活性均高于M 和L。贺军芳等［35］以E.coli BL21（DE3）为宿主细胞，pET-SUMO为表达载体，获得融合表达抗菌肽LHH1，其对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性，且对山羊血红细胞的溶血毒性较低，但其相对分子质量也较大（11 200），使肽及其载体占有较高比例。

另外，GST 可作为亲和标签纯化融合蛋白，硫氧还蛋白和SUMO 则需要额外的亲和标签来纯化融合蛋白，最常使用的是His-tag。ZHANG 等［36］将PGLa-AM1 基因与家蚕抗菌肽基因相连接，并在融合蛋白末端添加6 × His，转入E.coli 进行表达，产量达30 mg ／ L。SHI 等［15］将Pa-MAP 2 与ELP-intein 融合表达，产量高达96 mg ／ L。但亲和标签与不同抗菌肽融合表达的产量存在明显差异，Trx 与G13 融合表达后产量为200 mg ／ L［13］，而Trx 与Fowlicidin-2融合表达的产量仅有6 mg ／ L［9］。另外，同一抗菌肽使用不同融合标签重组表达产量亦有所不同，Plectasin 与SUMO 融合表达产量可达41 mg ／ L［7］，而与GST 和Intein2 融合表达的产量仅有24.3 和23.8 mg ／ L［8］。因此应根据抗菌肽性质进行选择，以有效提高融合蛋白的表达率。

2 偏爱密码子的选择

根据宿主对密码子的偏爱性设计合成抗菌肽的编码基因，可提高融合蛋白表达率。许国芹等［37］根据E.coli 密码子偏爱性原则推测EP 基因核苷酸序列，构建pET32a-EP 融合表达质粒，成功表达出重组蛋白。王莲哲等［38］根据毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子偏爱性进行优化，合成树蛙抗菌肽Cathelicidin目的基因，与表达载体pPIC9K 连接后电击转化至毕赤酵母GS115，分泌表达的抗菌肽对金黄色葡萄球菌和E.coli 具有抑菌活性。于婷等［39］依据毕赤酵母密码子偏爱性原则编码杂合肽Me-HNP1 基因，选择蜂毒肽（melittin）和人体防御素（huamn defensin-1，HNP-1）部分基因序列进行人工融合，克隆至穿梭型表达载体pPICZα A 上，成功构建分泌表达质粒pPICZαAMe-HNP1。

3 表达菌株的选择

为提高真核蛋白的成功表达率，表达菌株的选择亦十分重要。

3.1 原核表达系统 原核表达系统，特别是E.coli表达系统，具有基因导入方便、易操作、产量高、生长速度快、成本较低等优点，受到人们的青睐。E.coli BL21（DE3）通常用作宿主菌株，但其不能表达含有二硫键的抗菌肽融合蛋白，常生成包涵体［18，40］；E.coli菌株Origami 或Rosetta-Gami 特别用于生产富含二硫键的抗菌肽；Rosetta 系列菌株含有原本在E.coli中稀少的真核细胞密码子，因此可有效增加真核细胞的蛋白表达水平。LIN 等［25］用E.coli Rosetta（DE3）异源表达获得DEFB118 蛋白，产量达250 μg ／ mL，且对E.coli、金黄色葡萄球菌和枯草杆菌均表现出抗菌活性。马文君等［41］实现了人汗腺抗菌素（Dermcidins，DCD-1L）的原核异源可溶表达，构建质粒并转化E.coli ER2566，表达产物对表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）等革兰阳性菌较E.coli 具有更显著的抑菌活性。另外，枯草芽孢杆菌也可作为E.coli 的替代原核表达系统来生产抗菌肽，包括Plectasin［7］、cathelicidin［42］和hybrid cecropin A-melittin［43］等，但该表达系统表达率有时比E.coli 低［44］。

3.2 真核表达系统 在真核表达系统中，应用最广泛的为酵母表达系统，其具有生长迅速、易于进行基因工程改造、能够对外源性蛋白进行正确加工和后期修饰等优点。酵母表达系统中的宿主载体主要是毕赤酵母和酿酒酵母。其中毕赤酵母表达系统操作简单，营养要求低，可进行高密度发酵和大规模生产；其本身带有强醇氧化启动子1（aacoholoxidase1，AOX1），可通过改变甲醇在培养基中的浓度来调控表达。目前，已有多种抗菌肽在毕赤酵母中成功表达。ZHAN 等［26］将PRW4 与6×His-TrxA 融合并连接至载体pPICZαA，在毕赤酵母GS115 中表达融合蛋白，结果表明，重组PRW4 对E.coli、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等细菌具有与合成PRW4 相似的抗菌活性。WANG等［30］将设计的牛乳铁素衍生肽（LfcinBD）基因片段插入至质粒pPIC9K-His，构建重组表达质粒，在相同发酵条件下，LfcinBD 对金黄色葡萄球菌的抑菌活性强于天然牛乳铁蛋白肽（LfcinB）。王莎莎等［45］构建了产斑点叉尾鮰β-防御素（ictalurus punctatus βdefensin，IPBD）的毕赤酵母重组菌株，实现了基于真核表达的IPBD 的生物合成，结果表明，重组IPBD 对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）及铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抑菌率分别为69.6%、71.6% 和65.8%。王莲哲等［27］利用毕赤酵母表达抗菌肽Temporin-SHf 构建pPIC9K-Temporin-SHf 表达质粒，分泌表达的抗菌肽对金黄色葡萄球菌和E.coli 具有较强抑菌活性。酿酒酵母作为宿主菌进行异源蛋白生产操作简单，能够对表达异源蛋白进行必要的修饰和加工，保持外源蛋白的结构稳定和生物学活性。荣慧杰等［46］通过融合牛乳铁蛋白肽（LfcinB）基因与红色荧光蛋白（mApple）基因，构建以mApple 为报告基因的酵母表达质粒，得到融合表达重组蛋白LfcinB-mApple，其对E.coli DH5α、金黄色葡萄球菌均有明显抑菌活性。但该表达系统也存在一些缺陷，如在发酵过程中会产生酒精，可能对表达产物产生不利影响，无法完整加工信号肽，产物易过度糖基化，这些限制了其在异源蛋白重组表达中的应用。

另外，有些抗菌肽在原核和真核表达系统中均可表达，获得融合蛋白。凡复等［47］在E.coli 中转入仔猪骨髓组织抗菌肽（protegrin-1，PG1）的成熟肽基因，构建可表达融合蛋白的GST-PG1 基因工程菌，该重组菌具有显著的抗菌效果。还可将编码成熟PG1 的DNA 序列与6×His 标签融合，克隆至载体pPICZαA中，再转入毕赤酵母中，表达的PG1／6×His 对HepG2细胞具有较强抗癌活性［48］。吴玲梅等［49］为研究太平洋鳕（Gadusmacrocephalus）抗菌肽Hepcidin（GmHep）的分子结构和表达特性，分别成功构建了原核（pET-32a-GmHep）和真核（pEGFP-GmHep）表达质粒，分别转化E.coli BL21（DE3），0.01mmol ／ L IPTG 于30 ℃诱导4 h,可大量表达目的蛋白；转染鲤上皮瘤细胞，在细胞质中可观察到明显绿色荧光，表明GmHep 蛋白成功表达且定位于细胞质。

4 基因共表达策略

将2 个或2 个以上的单个相同或不同抗菌肽基因通过特定连接点或结构连接，构建至特定的表达载体中，可有效增加外源蛋白的可溶性和产量，与辅酶共表达可获得活性蛋白，还能实现生物功能相关蛋白的共表达。

4.1 单启动子表达系统 在单启动子表达系统中，1 个转录单元是由“promoter-ORF（s）-terminator T”序列构成，基因之间由一段DNA 序列连接，多个基因以多顺反子的形式转录和翻译。这种表达系统比较简便、灵活。刘珂杭等［50］利用SUMO 融合标签在E.coli 系统中通过串联表达制备重组LfcinB，结果显示，大于90%的SUMO-（LfcinB）n 蛋白以可溶形式表达于E.coli BL21（DE3）细胞中；SUMO-（LfcinB）2的表达量高于SUMO-LfcinB 和SUMO-（LfcinB）3，通过SUMO 特异性蛋白酶切除SUMO 标签，羟胺释放单体，获得纯化的重组LfcinB，产率约为15 mg ／ L，具有一定的抗菌和抗肿瘤活性。XU 等［51］通过将猪β-防御素-2（porcine β-defensin-2，pBD-2）和天蚕素-P1（cecropin P1，CP1）融合基因插入载体pMK4，转化后获得表达融合肽的枯草芽孢杆菌，其保留了较好抗菌活性，同时大幅降低了对宿主菌生长的干扰，且可显著促进仔猪生长。FAN 等［52］为实现猪β-防御素-1（porcine β-defensin-1，pBD-1）在巴斯德毕赤酵母中的高效表达，设计合成pBD-1 三倍串联体（3pBD-1）基因序列，构建重组表达质粒pHLI-S1-3pBD-1。单启动子表达系统也存在一些缺点，如基因在载体上的顺序影响其表达水平，启动子后第1 个基因编码的蛋白表达率明显要高；两个基因之间起连接作用的DNA序列大小和组成，也可影响基因的表达水平；载体的容量有限，一般难以装入4 个以上的基因；转录单元可能导致质粒不稳定，转化过程中易发生序列丢失。

4.2 多启动子共表达体系 在多启动子共表达体系中，所有基因均可单独转录，获得各自的mRNA 转录产物。该表达系统能有效减少单一基因载体的转化次数，还能克服共表达中基因表达水平难以控制等问题。KUDDUS 等［53］将分子伴侣HLA 与SN-1 通过构建pCOLADuet1-HLA-SN-1 共表达体系，使目标蛋白SN-1 的表达量明显升高；SATOSHI 等［54］将ABF-2与4 个不同分子伴侣通过载体pCOLADuet-1 分别构建pCOLA-［HLA］-ABF-2、pCOLA-［BLA］-ABF-2、pCOLA-［HLZ］-ABF-2、pCOLA-Microbicidal assay［BLZ］-ABF-2和pCOLA-ABF-2 等共表达体系，也实现了提高目标蛋白产量和活性的目的。THOMAS 等［55］将Sericin的部分序列和Cecropin B 重组，连接至表达载体pET-47b（+），使这两种难以表达的蛋白均在E.coli中表达，且融合蛋白的杀菌活性更强。CHEN 等［56］构建pVAX1 融合抗菌肽与白细胞介素-2 基因真核共表达质粒CAMPS-2A-IL-2（VAP2），获得的融合蛋白能有效防止病原微生物感染小鼠，增强机体的体液免疫和细胞免疫能力，且效果明显优于单一抗菌肽融合基因，表明抗菌肽融合基因与白细胞介素-2 的共表达对动物有更好的保护效应。该表达系统也存在一些缺点，如多个启动子会占据载体的克隆空间，减少了装载基因的数量；多个启动子之间可能会互相干扰，影响目的基因的表达；若装载基因过多，载体太大，质粒在宿主菌中可能不稳定。

4.3 双质粒共表达系统 在双质粒共表达系统中，将不同外源基因分别构建至不同载体，构建出重组质粒，再将这些重组质粒同时或分步导入同一宿主细胞，也可实现外源基因的共表达。PENG 等［57］将CAMPs片段分别克隆至真核表达质粒pPIC9K 和pPICZαA中，成功构建了重组质粒pPIC9K-CAMPs 和pPICZαACAMPs，获得了GS-PKZ-CAMPs 可诱导表达菌株。但这种表达系统对载体的要求较高，如用于共转化的载体应含有不同的抗生素选择标记，还应含有不同的复制起点（p15A 和ColE1）及相似的拷贝数。有研究表明，同时满足以上条件时，单一载体多重转化后亦可能不发生共表达［58］。因此这种技术受到了一些限制，分析原因可能为：共表达基因较多时，技术操作工作量大；多个基因共转化使可转入细胞数量减少；多种抗生素共存，细胞的生长速率减慢；质粒之间存在不兼容的情况。

5 融合蛋白纯化方法的优化

融合蛋白纯化的方法及条件取决于表达宿主生物及融合标签，较多依赖于色谱法，一些融合标签使基于非色谱的融合蛋白纯化成为可能。GUO 等［28］将Oxysterlin 1 基因克隆至含有弹性蛋白样多肽（Elastinlike polypeptide，ELP）和蛋白质内含肽（Intein）基因的质粒中，构建重组表达质粒pET-ELP-I-Oxysterlin 1，重组蛋白主要以可溶性形式表达，进而通过简单的盐析和pH 改变即可对目标小肽进行纯化，最终获得Oxysterlin 1 的产量约为1.2 mg ／ L。SUN 等［11］设计了一种具有酸性裂解位点的四螺旋蛋白DAMP4，与抗菌肽Pexiganan 融合，DAMP4var-Pexiganan 融合蛋白保留了DAMP4 的高温稳定性，因此只能用热和盐沉淀的方法从细胞中纯化，从而消除了基于色谱的纯化步骤。SUN 等［12］开发了一种新的融合蛋白DAMP4-F-Pexiganan，避免了基于色谱的纯化和酶切的步骤，与微生物生产抗菌肽的传统方法比较，具有较大优势。

6 基因表达设计的优化

抗菌肽的融合表达可通过多方面、多环节条件的优化来提高其表达量。邓赣奇等［59］为获得一种能分泌菌丝霉素的毕赤酵母菌并探讨其活性，将优化的目的蛋白碱基序列与标签MBP 基因序列融合，通过双酶切将重组基因序列插入至表达载体毕赤酵母pGAPZaA，获得的重组蛋白经纯化后对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。PARVANEH 等［24］设计并生产了MagaininⅡ作为重组融合蛋白的类似物，该序列含有24 个氨基酸残基（P24），其中Lys、His、Ser 残基被Arg 取代，疏水Phe 被Trp 取代，利用pTYB21在E.coli 中重组产生P24，其对革兰阳性菌具有较强的抗菌活性，比Pexigananan 更有效。MONTFORTGARDEAZABEL 等［29］分别利用融合蛋白CuF3H+和SmbP 与抗菌肽Bin1b 在E.coli 中共表达，经分离纯化获得的Bin1b 对金黄色葡萄球菌表现出抗菌活性。叶若柏等［60］构建了用E.coli 表达内含肽介导的MME 重组质粒，通过表达获得依次由组氨酸、SUMO、MME、内含肽构成的融合蛋白，并在Mesna 与NH4HCO3存在下，促进了内含肽自剪切，MME 碳末端被酰胺化，实现了简单的“一步法”制备。WANMAKOK 等［61］构建了1 个由人LL-37 和组蛋白5（Hst-5）两个截短的活性形式组成的AL32-P113 杂交肽基因，克隆至质粒pTXB-1 中，并在E.coli BL21（DE3）中表达，结果表明，两种杂交肽均对革兰阴性菌和酵母细胞具有较强的抗菌活性，而L31-P113 肽对革兰阳性菌的抗菌活性约为LL-37 的4 倍，且这些杂交多肽对人红细胞的溶血作用增加，表明杂交多肽对病原菌具有更广泛、更强的抗菌能力，未来可作为局部治疗微生物感染的一种治疗方法。

7 小结与展望

目前，虽已开发了各种高效率和低成本的抗菌肽重组表达系统和方法，但该领域仍具有较大的发展潜力。近期开发的最有效的基因编辑技术之一CRISPR-Cas，是基于细菌中的自然防御机制来控制病原体，CRIDPR RNA（crRNA）结合Cas9 内切酶在其靶向区域形成双链断裂，同时利用同源重组、非同源末端连接等方法精确敲入大片段外源基因［62］。CRISPR-Cas 介导的基因修复、破坏、插入或缺失已在生物医学研究、医学、农业和生物技术等多个领域得到应用。将基因编辑工具与现有的基因工程方法相结合，使抗菌肽的生产变得更简便、更快捷。另外，CRISPR-Cas9 介导的基因沉默、基因敲除或特定DNA序列的操纵也可促进异源抗菌肽的产生、正确快速的折叠或适当的翻译后加工修饰。

生产高纯度和高活性的抗菌肽对其在药物和治疗中的应用具有重要意义。传统的抗菌肽重组表达遇到了许多困难，如由于抗菌肽对其细菌宿主的毒性而导致低表达产量，从融合蛋白中释放和纯化抗菌肽的繁琐过程导致低生产量，进而限制其规模化生产。相信随着科学技术的发展，未来一定能够研发出一种成本低且可高效表达抗菌肽的系统。