SARS-CoV-2检测方法的研究进展

黄慧丽 综述，吴佳静，梁春南 审校

中国食品药品检定研究院，北京 102629

2020 年，新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）疫情肆虐全球［1-2］，确诊病例和死亡人数持续增加，该病传播能力强、危险系数高、防控难度大。国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）将造成本次疫情的病毒命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）［3］。2020 年12 月14 日，英国向WHO 报告了一种病毒变体D614G［4］，传播能力比普通的SARSCoV-2 高70%，加剧了疫情发展的不确定性，同时增加了疫苗研发的困难［5-7］。截至2021 年2 月，全球累计确诊病例超1.1 亿，累计死亡病例已超253 万，对人类社会产生了严重影响［8-11］。

SARS-Cov-2 在分类学上属于冠状病毒科和Sarbecovirus 病毒亚属［3］，是一种有包膜、单股正链RNA病毒，基因序列长度约为30 000 bp，主要由核衣壳蛋白、包膜蛋白、刺突表面糖蛋白和基质蛋白等相关蛋白组成［5］。SARS-Cov-2 主要通过呼吸道飞沫和人体密切接触传播［12］，人感染后一般会有数天无症状潜伏期［13］，后续可出现乏力、干咳、发热等症状，易判别；另有一些病例长期无症状但携带病毒［14］，增加了诊断的困难，不利于疫情的控制。因此，针对正常人群、疑似病例、无症状感染者进行快速、准确诊断与筛查是COVID-19 防控工作中最初和最重要的环节［15-16］。本文主要就应用于COVID-19 诊断的核酸检测法、抗体检测法及抗原检测法的研究进展作一综述。

1 核酸检测法

病毒RNA 序列是区分病毒与其他病原体的特异性标志物，因此病毒RNA 检测是COVID-19 前期诊断的金标准。目前，SARS-CoV-2 检测的核酸片段主要有ORF1ab 基因、N 基因、E 基因、S 基因等［17-18］。检测方法主要包括实时荧光定量PCR 法（quantitative real time PCR，RT-PCR）、环介导等温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技术、成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）基因组编辑技术、数字PCR（digital PCR，dPCR）技术、全基因组测序等。

1.1 RT-PCR 法 该方法是利用反转录酶将RNA片段反转录为互补的单链DNA 序列，在特定引物的作用下，将其经PCR 反应扩增获得双链DNA，利用信号基团实现目标基因检测［19］。COVID-19 诊疗方案（试行第八版）规定，疑似病例经RT-PCR 检测为阳性者即为COVID-19 确诊病例［20］。RT-PCR 法灵敏度高、特异性好、快速、方便且成本低，是目前COVID-19最常用的诊断技术，其关键点是特异性引物的设计［21］。YÜCE 等［16］对用于检测SARS-CoV-2 相关基因的引物序列进行了总结，这些引物组成不同，检测的灵敏度及特异性也较高。JUNG 等［22］对不同引物对应的检测能力进行了比较，结果表明，检测N 基因及ORF1基因的最灵敏引物分别为2019-nCoV N2 与N3（美国）及ORF1ab（中国）。NALLA 等［23］通过实验验证了CORMAN 等［24］针对E 基因检测设计的引物序列具有高灵敏性和特异性。

目前，已有多种RT-PCR 试剂盒获批，但准确率尚有待提高。SHEN 等［25］采用4 种国内已通过审批的试剂盒对142 份COVID-19 患者鼻咽拭子样本进行检测，阳性率为80% ~ 92%；对82 份COVID-19 患者痰液样本进行检测，阳性率为82% ~ 94%。GARG等［26］采用7 种国外的RT-PCR 试剂盒分别检测了40 个阳性样本，仅有4 个品牌的试剂盒检测的阳性率为100%，其他3 个试剂盒阳性检测率分别为90%、85%和75%。为提高试剂盒的检测灵敏度和准确性，研究者一直在开发更为高效的RT-PCR 检测方法，如endpoint RT-PCR［27］、multiplex real-time RT-PCR［28］和droplet digital RT-PCR［29］等。

目前，RT-PCR 检测在疫情防控中发挥了重要作用，是疑似病例排除和接触者解除隔离的主要判断依据［30］。由于SARS-CoV-2 为RNA 病毒，RNA 易降解，因此采集样本时需使用无RNA 酶的拭子和储存管。另外，该检测方法需要分子检测实验室和专业的仪器及操作人员，操作不当或实验室条件不足均可能会由于气溶胶污染而造成假阳性。

1.2 LAMP 方法 该方法是利用靶基因的特异性引物及链置换DNA 聚合酶，在恒温条件下反应30 ~60 min，即可实现核酸109~1010倍的扩增。LAMP 方法不需要模板的高温热变性、温度循环等过程，更加快速、简单，在灵敏度、特异性和检测范围等指标上相当甚至优于RT-PCR 法。目前，已有LAMP 检测试剂盒获批，如由博奥生物集团有限公司联合清华大学、四川大学华西医院共同设计开发的用于6 项呼吸道病毒恒温扩增芯片试剂盒，能够特异性检测SARS-CoV-2，检测时间只需1.5 h。YU 等［31］设计靶向性扩增ORF1ab 基因引物，建立了RT-LAMP 检测SARS-CoV-2 的方法，检测时间仅为15 ~ 40 min，对248 份COVID-19 患者样本阳性检出率为89.9%（223／248），与RT-PCR 的检出效率基本一致，表明该方法具有良好的可靠性及应用潜能。THI 等［32］设计了一组针对N 基因的引物，并开发了一种双色LAMP 检测方法，检测768 份COVID-19 患者咽拭子样本，表现出较高的灵敏度与特异性，分别为97.5%与99.7%。LAMP 方法中的引物设计相比于RT-PCR 要求要高，增加了应用难度；另外，LAMP 高灵敏度的优点有时反而限制了其应用，即易产生气溶胶污染造成假阳性。

1.3 CRISPR 技术 向导RNA 能够指导Cas 蛋白识别并切割带有SARS-CoV-2 特异序列的RNA分子，在整个体系中加入带有荧光标记的信号分子，一旦RNA 被切开，就会发出荧光信号。利用该特点实现对SARS-CoV-2 的特异性、高灵敏度检测［33］。BROUGHTON 等［34］报道了一种基于CRISPR-Cas12系统检测SARS-CoV-2 的试纸条方法，仅需40 min 即可完成检测，通过对36 名COVID-19 患者和42 名其他呼吸道疾病患者的咽拭子样品进行检测，表明试纸条具有较好的灵敏度和特异性（分别为95%及100%）。ZHANG 等［35］开发了一种基于CRISPR-SHERLOCK系统检测SARS-CoV-2 的试纸条，灵敏度达到单分子级。该团队又利用磁珠法简化了SARS-CoV-2 RNA 富集过程，缩减至15 min，开发了一款智能手机APP 帮助检测人员对结果进行解读，采用该方法检测202 份COVID-19 阳性患者和200 个阴性人群的鼻咽拭子样本，灵敏度和特异性均较高，分别为93.1%及98.5%［36］。

2020 年11 月24 日，国家药品监督管理局批准国内首个利用CRISPR 技术检测SARS-CoV-2 的试剂盒（CRISPR 免疫层析法）使用，由杭州众测生物科技有限公司与军事科学院军事医学研究院联合研发。该产品结合重组酶介导恒温核酸扩增技术的灵敏性和CRISPR 基因编辑技术的特异性，在恒温条件下进行核酸的扩增及检测，同时可在试纸条上读取结果。目前，有多种基于CRISPR 技术的方法处于研发中，如CRISPR／Cas9 系统［37］、CRISPR／Cas13a 系统［38］、RT-LAMP-CRISPR 联用方法［39］等。但CRISPR 系统研究时间较短，仍存在脱靶的可能。

1.4 数字PCR 技术 将PCR 反应体系缩小至微滴阵列中，灵敏度可实现单个核酸分子的检测，具有更高的检测精度。TAN 等［40］对数字PCR 在COVID-19疫情与相关临床应用中的改进和发展方向提出了见解，数字PCR 可实现复杂基质的SARS-CoV-2 检测，如精子、全血、尿液、粪便等。2021 年1 月1 日，光明日报报道了国际计量局关于SARS-CoV-2 核酸测量国际比对结果，结果表明，数字PCR 法可在全世界范围内实现对SARS-CoV-2 核酸含量的高精确测量［41］。上述结论将有助于数字PCR 技术应用于COVID-19的诊断。

1.5 全基因组测序 利用高通量测序技术，可在第一时间获取新发现未知病毒的基因组序列信息，能够精准鉴定病毒类型［42］。COVID-19 诊疗方案（试行第八版）规定，疑似病例病毒基因测序与已知的SARS-CoV-2 高度同源即为确诊病例［20］。如2020年12 月14 日，英国通过病毒基因测序发现一种新的SARS-CoV-2 变体［4］，传播能力比普通的SARS-CoV-2高70%，加剧了疫情发展的不确定性。ZHOU 等［43］利用基因测序构建进化树揭示SARS-CoV-2 相关特性，分析了病毒的自然宿主溯源、病毒向人传播的途径、病毒的致病病理机制等，并指出SARS-CoV-2在动物中变异后对人健康的影响还需更多深入的研究。由于测序过程繁琐、时间较长、成本也较高，在常规防疫检测中应用较少。但该技术对病毒的鉴定、溯源、流行病学调查及疫苗研发具有重要作用。

2 抗体检测法

SARS-CoV-2 入侵人体后，可刺激人体免疫细胞产生具有保护作用的免疫球蛋白，其中IgM 抗体产生于病毒感染后5 ～7 d，随后消失；IgG 抗体产生于感染后10 ～15 d，于人体血清中存在时间较长。因此通过检测患者血液中SARS-CoV-2 特异性IgM 和IgG 抗体，有助于判断患者所处感染的时期。尤其针对无症状感染者，核酸联用抗体检测有利于对人群进行分层管理：若IgG 呈阳性但IgM 呈阴性，表明受检者曾感染过病毒但已产生抗体，不再需要隔离；如果两者均呈阳性，表明受检者可能是已感染病毒但尚未出现症状，需要进行医学观察与隔离。COVID-19诊疗方案（试行第八版）规定，新增疑似病例满足以下一条即为确诊病例：血清SARS-CoV-2 特异性IgM和IgG 抗体均呈阳性；血清SARS-CoV-2 特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期高4 倍及4倍以上［20］。目前抗体检测方法主要有试纸条方法、化学发光法和酶联免疫检测方法等。

2.1 试纸条法 试纸条法操作简便，其试剂盒易于商品化，适用于大规模人群的筛查［44-45］。常见检测信号包括荧光和胶体金两种，前者可通过简单的手持仪器照射显示结果，灵敏度较高；后者可实现肉眼观察结果，方便实用。目前常用的为胶体金显色，如国家药品监督管理局批准的浙江东方基因生物制品股份有限公司研发的胶体金检测试剂盒，可在15 min 内实现人全血、血清或血浆中的IgG 和IgM抗体检测。但该方法存在灵敏度低、无法定量、有暴露风险等局限。目前，一些高灵敏度的技术应用于试纸条，如以纳米银球为基础的试纸条，量子点荧光试纸条等。

2.2 化学发光法 该方法的原理是将SARS-CoV-2抗原蛋白包被在微粒上，抗原蛋白结合COVID-19患者血清中的IgG ／ IgM，随后加入化学标记的人IgG ／ IgM 二抗，经过清洗去除游离态的化学标记物后再加入发光底物产生化学发光，通过测量光信号完成对血清中IgG ／ IgM 的定性或定量检测［46］。目前获得审批产品中应用的化学发光法分为4 类：酶促化学发光法（如天津博奥赛斯生物科技股份有限公司的IgG 与IgM 检测试剂盒）、直接化学发光法（如迈克生物股份有限公司IgG 与IgM 检测试剂盒）、微粒化学发光法（如深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司的IgG 与IgM 磁微粒检测试剂盒，厦门万泰凯瑞生物技术有限公司的化学发光微粒子免疫检测法）、上转换发光免疫层析法（如北京热景生物技术有限公司的抗体检测试剂盒）。化学发光法是一种比较先进的免疫检测技术，能够达到定量检测的目的，具有自动化程度高、操作简便、特异性强、方法稳定及灵敏度高等优点，但仪器及试剂成本较高，大规模筛查有难度。

2.3 ELISA 法 该方法是抗原抗体反应与酶科学相互结合的一种常见免疫分析方法，标本中的抗体（抗原）与固相载体表面的抗原（抗体）发生特异性反应形成抗原抗体复合物，加入酶标记的抗原或抗体后也在固相载体表面发生复合，由于固相载体中受标检测物与酶的量呈一定的比列关系，通过酶催化底物颜色的变化进行定性或定量分析，从而达到检测的目的［47］。目前用于SARS-CoV-2 检测的ELISA 法基本有3 种：①双抗原夹心法检测患者血清中的总抗，使用的抗原蛋白是SARS-CoV-2 S 蛋白的RBD；②捕获法检测患者血清中的IgM，使用的抗原蛋白是HRP 标记的RBD；③间接法检测患者血清中的IgG，使用的抗原蛋白是SARS-CoV-2 N 蛋白。

ELISA 法对设备要求低、检测灵敏度高，操作方法简便，特异性较强，且检测成本低，但由于操作步骤多，耗时较长，通常只能进行定性或半定量检测，该技术比较适合基层的检测机构用于大规模筛查。该方法可能会由于标本中存在干扰物质（如类风湿因子、嗜异性抗体、补体、溶菌酶等）、标本溶血、标本被细菌污染、标本凝固不全残留有纤维蛋白原等因素影响而出现假阳性结果。

3 抗原检测法

SARS-CoV-2 的结构蛋白是其特异性的标志物，也是刺激患者产生特异性抗体的抗原。在SARSCoV-2 组成中，蛋白含量远大于RNA 核酸，因此检测抗原也是检测SARS-CoV-2 的一种途径［48-49］。但病毒表面抗原蛋白易产生变异，给抗原检测带来了一定的困难。抗原检测步骤总体与抗体方法一致。目前，已有少数的抗原检测试剂盒获得审批，如广州万孚生物技术股份有限公司生产的SARS-CoV-2 抗原检测试剂盒（胶体金法），产品检测耗时为20 min以内，在急性感染期病毒载量较高时能够快速检出阳性病例，可用于对疑似病例进行早期分流和快速管理；深圳华大因源医药科技有限公司研发的抗原荧光检测试纸条，操作十分简单，非专业人员也可以轻松掌握。

目前，抗原检测法作为现有检测方法的补充，不能单独用于SARS-CoV-2 感染的诊断，结果应结合核酸检测、影像学等其他诊断信息及病史、接触史判断感染状态。疑似人群抗原阳性及阴性结果均应进行进一步的核酸检测。随着SARS-CoV-2 灭活疫苗的广泛接种，血清学检测指标用于诊断效力下降，而抗原指标是直接与病毒感染相关的指标，可与核酸检测互补，以发挥更大的诊断价值［50-51］。

4 小 结

国家药品监督管理局在“早期介入、随到随审、科学审批”的指导原则下，2020 年已批准50 多个COVID-19 诊断试剂上市，累计日产能达2 400 万人份，基本可满足检测需求。目前，国内形势已基本稳定，但仍有零星病例不断出现。另外，国际疫情局势仍较严峻，为防止病例境外输入传播，入境卡口可采用多次结合多种方法进行检测，有效阻止病毒传播。我国大部分人群已接种COVID-19 疫苗，因此也要求抗体检测产品能够区别疫苗抗体和实际感染诱导的抗体。不同原理的检测方法具有各自的优势，结合使用可互补其缺点，提高检测准确率，确保尽早筛查COVID-19 患者，及时进行隔离及治疗，有效防止疫情扩散。