胰高血糖素样肽-1 受体激动剂融合蛋白纯度反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

高雪峰，王婉如，郑伟峰，杨军，张艳丽，马亚茹，陈勇

兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室 甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃 兰州 730046

糖尿病是血葡萄糖水平缓慢升高的慢性代谢性疾病，可导致多种并发症，严重时可危及生命。糖尿病分为1 型和2 型，主要是由遗传和环境因素引起的代谢紊乱，导致胰岛素不敏感、胰岛素缺乏和生物学功能受损。不健康饮食、运动减少、超重、肥胖及衰老等因素，均有可能提高糖尿病发病率［1］。2019 年，全球约有4.63 亿20 ~ 79 岁的糖尿病患者，预计至2030 年，患者将达5.78 亿，2050 年将超过7 亿［2］。

胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是一种肠促胰岛素，通过与GLP-1 受体结合发挥降血糖作用，但GLP-1 易被二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）分解，从而造成药物疗效降低［3］。如礼来公司（Eli Lilly and Company）的艾塞那肽需每天注射2 次才能有效控制血糖［4-7］，后续该公司基于Fc 片段连接2 个GLP-1 分子研发出的长效GLP-1 受体激动剂（杜拉鲁肽）已成功上市，具有注射间隔长、降糖效果好、低血糖风险低和心血管获益的优点［8-13］。兰州生物制品研究所有限责任公司研发的GLP-1 受体激动剂融合蛋白是将2 个GLP-1 受体激动剂与Fc片段相连，通过优化基因结构，极大延长了药物在体内半衰期［14-16］，减少了注射频次，提高了患者的依从性。反相高效液相色谱（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）是由非极性固定相和极性流动相组成的液相色谱体系，是目前液相色谱中最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的蛋白质。RP-HPLC 通过蛋白质的保留性质及选择性进行非极性、极性或离子型物质分离，分析待测样品的纯度。本实验参考《中国药典》三部（2015 版）蛋白质类药物纯度的检测方法［17］，建立用于GLP-1 受体激动剂融合蛋白纯度检测的RP-HPLC 法，并进行验证，以期用于药物的质量控制和评价。

1 材料与方法

1.1 样品及参比品 GLP-1 受体激动剂融合蛋白（批号：H-20181109、H-20181211、H-20190301、H-2019-0603、H-20190704、H-20190805，宿主细胞残余DNA、HCP、Protein A 等杂质含量均合格）及其参比品（SECHPLC 纯度：99.57%，批号：20180505，浓度：6.9 mg／mL）均由兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室提供。

1.2 主要试剂及仪器 三氟乙酸购自美国TEDIA公司；乙腈购自美国Fisher 公司；抗凝血酶-Ⅲ（antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ）及睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）均由兰州生物制品研究所有限责任公司第四研究室自制；1200 Infinity Series 高效液相色谱系统、Agilent ZORBAX 300Extend-C18（4.6 mm × 150 mm）分析柱和ZORBAX 300Extend-C18（4.6 mm × 12.5 mm）保护柱均购自美国Agilent公司；脱气滤膜和针头滤器购自美国Millipore 公司。

1.3 方法的建立 取GLP-1 受体激动剂融合蛋白待检样品100 μL，用纯水稀释至0.25 mg ／ mL，经针头滤器过滤。采用Agilent ZORBAX 300Extend-C18（4.6 mm × 150 mm）分析柱和ZORBAX 300Extend-C18（4.6 mm × 12.5 mm）保护柱。色谱条件：流动相A 液：0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B 液：0.1%三氟乙酸的乙腈溶液；上样体积：100 μL；抽取速度：200 μL ／ min，排出速度：200 μL ／ min；工作流速：0.50 mL ／ min；A 相溶液平衡系统至基线平稳，开始进样；0~5 min：0~50%B；5~15 min：50%~60%B；15 ~ 20 min：60% ~ 100% B；20 ~ 30 min：100% B；8 min：100%A；检测波长：280 nm；柱温箱温度：40 ℃。

1.4 方法的验证

1.4.1 系统适用性 将GLP-1 受体激动剂融合蛋白参比品稀释至0.25 mg ／ mL，按1.3 项方法进行上样，记录色谱图，计算塔板数和对称因子，理论塔板数应＞10 000，峰对称性应＞0.5。

1.4.2 专属性 将空白对照（稀释剂）、GLP-1 受体激动剂融合蛋白参比品（稀释为0.25 mg ／ mL）、阴性对照（AT-Ⅲ和CNTF）按1.3 项方法进行上样，记录色谱图，稀释剂、AT-Ⅲ和CNTF 色谱图应无干扰峰，GLP-1 受体激动剂融合蛋白与AT-Ⅲ和CNTF 分离度应＞1.5。

1.4.3 灵敏度 将GLP-1 受体激动剂融合蛋白参比品稀释至10 μg ／ mL，与空白对照（稀释剂）按1.3 项方法进行上样，计算信噪比（S ／ N），以S ／ N 为1 ∶3时的浓度为灵敏度。

1.4.4 精密性

1.4.4.1 重复性 将GLP-1 受体激动剂融合蛋白参比品稀释为0.25 mg ／ mL，按1.3 项方法连续进样6 次，计算进样峰面积百分比和保留时间的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），峰面积百分比RSD 及保留时间RSD 均应≤2%。

1.4.4.2 中间精密度 将GLP-1 受体激动剂融合蛋白参比品稀释为0.25 mg ／ mL，由2 名实验人员（A 和B）按1.3 项方法进样，每人各3 份，连续检测3 d，每天进样1 针。计算6 次进样峰面积百分比和保留时间的RSD，峰面积百分比RSD 及保留时间RSD 应≤2%。

1.4.5 耐用性 高效液相色谱系统柱温分别调整为35、40、45 ℃。将GLP-1 受体激动剂融合蛋白参比品稀释为0.25 mg ／ mL，按1.3 项方法进样，每个温度进样2 次，计算6 次进样峰面积百分比和保留时间的RSD，峰面积百分比RSD 及保留时间RSD应≤5%。

1.5 方法的初步应用 采用建立的RP-HPLC 法对6 批GLP-1 受体激动剂融合蛋白的纯度进行检测。

2 结 果

2.1 方法的验证

2.1.1 系统适用性 GLP-1 受体激动剂融合蛋白参比品保留时间为9.4 min，对称因子为0.64，理论塔板数为26 891，见图1。表明系统具有良好的适用性。

图1 系统适用性验证色谱图Fig.1 Chromatogram of verification for system suitability

2.1.2 专属性 GLP-1 受体激动剂融合蛋白参考品、AT-Ⅲ及CNTF 的保留时间为9.4、9.9、13.8 min，空白对照及阴性对照色谱图无干扰峰，GLP-1 受体激动剂融合蛋白与阴性对照分离度均＞1.5，见图2。表明该方法具有良好的专属性。

图2 专属性验证色谱图Fig.2 Chromatogram of verification for specificity

2.1.3 灵敏度 建立的RP-HPLC 法检测GLP-1 受体激动剂融合蛋白的灵敏度为4.8 μg ／ mL。

2.1.4 精密性

2.1.4.1 重复性 连续6 次进样的峰面积分别为2 843.72、2 858.67、2 860.93、2 856.70、2 871.85、2 869.14 μV·s，均值为2 860.17 μV·s，RSD 为0.35%；保留时间分别为9.418、9.417、9.411、9.414、9.414、9.400 min，均值为9.412 min，RSD 为0.07%。两者RSD 均≤2.0%，表明该方法具有良好的重复性。

2.1.4.2 中间精密度 实验员A 连续3 d 检测的保留时间分别为9.444、9.424、9.428 min，峰面积分别为2 893.01、2 951.43、2 774.55 μV·s；实验员B 连续3 d 检测的保留时间分别为9.445、9.441、9.447 min，峰面积分别为2 939.07、2 663.07、2 901.55 μV·s。6 次检测峰面积的RSD 为0.75%，保留时间RSD 为0.07%，均≤2.0%，表明该方法具有良好的中间精密性。

2.1.5 耐用性 3 种温度下，每个温度进样2 次，共6 次进样的峰面积的RSD 为3.93%，保留时间RSD 为0.10%，均≤5.0%，见表1。表明该方法具有良好的耐用性。

表1 耐用性验证结果Tab.1 Verification for durability

2.2 方法的初步应用 批号为H-20181109、H-20181211、H-20190301、H-20190603、H-20190704、H-20190805的GLP-1 受体激动剂融合蛋白的纯度分别为98.9%、98.6%、99.2%、99.2%、99.4%、100.0%，均＞95.0%。

3 讨 论

一般需结合两种不同原理的方法对重组蛋白原液的纯度进行检测，如SDS-PAGE 法结合HPLC 法。HPLC 法具有准确、快速、微量等检测优点，在生物制品研发及生产中，能够较好地完成蛋白原液纯度检测［18-24］。

蛋白质纯度是重组蛋白制备工艺中一项重要检测指标，不仅能评价分离工艺的有效性，还对制品的质量属性起到重要的监测作用，建立一种快速、准确的检测方法是监测产品质量的基础环节。参照《中国药典》四部（2015 版）0512 外标面积归一化法和ICH 指导原则、9101 药品质量标准分析方法验证指导原则［25-26］，本研究采用Agilent ZORBAX 300Extend-C18 分析柱及保护柱建立了GLP-1 受体激动剂融合蛋白纯度的RP-HPLC 检测法，并进行了验证。结果显示，该方法与阴性对照分离度均＞1.5；中间精密度峰面积及保留时间RSD均＜2.0%；重复性峰面积及保留时间RSD 均＜2.0%；耐用性峰面积和保留时间RSD 均＜5.0%；该方法的灵敏度为4.8 μg ／ mL。

综上所述，本研究建立的RP-HPLC 法具有良好的灵敏度、适用性、重复性、耐用性、且简单快捷，适用于GLP-1 受体激动剂融合蛋白纯度的检测，为产品工艺进一步开发提供了可靠的监测手段。