2020—2021 年冬季长春市水痘-带状疱疹病毒流行株基因特征分析

付兴烨，李晴，吕品，2，姜雪鸥，孟迪，张夫坤

1.长春祈健生物制品有限责任公司，吉林 长春 130000；2.吉林大学动物科学学院，吉林 长春 130062

水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）主要通过飞沫和疱疹破损液接触进行传播，皮肤和黏膜组织是主要靶器官。在原发感染后，部分VZV会长期潜伏于人体脊髓后跟神经节或颅神经的感觉神经节中，外伤、发热及免疫力低下均可能激发潜伏的VZV，引起带状疱疹，且VZV 具有高度传染性，隐蔽性较强［1-5］。VZV 基因组的遗传稳定性较高，但在迭代更替的过程中，表现出了明显的地域特征，不同国家地区毒株间的碱基存在一定差异，这种差异主要表现为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）［4］。不同基因型病毒的交叉感染可能导致病毒基因重组，形成新的基因型，因此，VZV 的基因分型对流行病学调查和水痘疫苗的安全性监测均具有重要意义［6-7］。

冬季是水痘和带状疱疹的高发季节，为更全面了解长春市冬季VZV 流行特征，本研究通过采集2020 — 2021 年冬季长春市水痘／ 带状疱疹患者的疱疹液样本，提取VZV 基因，检测其中VZV 的ORF22-SnP 位点碱基，以确定病毒的基因型；分析ORF38-PstⅠ、ORF54-BglⅠ、ORF62-SmaⅠ酶切位点，以确定流行病原是VZV 野毒株还是疫苗株。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 毒株 VZV 疫苗株（VZV-Oka，简称Oka 株）由长春祈健生物制品有限公司保存并提供。

1.2 样本 选择48 例2020 — 2021 年吉林省长春市中日联谊医院临床诊断为水痘或带状疱疹的患者为研究对象，无菌棉签蘸取患者的疱疹液，保存于病毒保存液中，于-78 ℃干冰保温箱运送至实验室，-70 ℃保存备用。

1.3 主要试剂 病毒DNA 提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；Premix Ex TaqTM购自日本TaKaRa 公司。

1.4 PCR 扩增 参考文献［8］设计PCR 引物，引物序列见表1，由吉林省库美生物科技有限公司合成。病毒DNA 提取试剂盒提取疱疹液样本中的VZV DNA，以其为模板，采用Premix Ex TaqTM酶PCR 扩增VZV 基因组ORF22、ORF38、ORF54 及ORF62 特异性片段。PCR 反应体系为：Premix Ex Taq 13 μL，Primer F ／ R 各0.75 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA 模板1 μL，共25 μL。PCR 反应条件为：98 ℃5 min；98 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃27 s，共30 个循环；72 ℃5 min。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析。并将鉴定正确的PCR 产物送吉林省库美生物科技有限公司进行测序。

1.5 ORF22 的SNP 位点分析 应用DNAMAN 软件将测序结果与各基因型代表株ORF22 的5 个SNP位点及2 个非SNP 位点进行比对分析。VZV 不同代表株ORF22 的SNP 位点碱基见表2，2 个非SNP 位点分别为37 990 和38 059，相应碱基均为A 和C。当标本基因序列与某基因型代表株的SNP 位点碱基完全一致时，判为同一基因型。

表2 VZV 不同代表株ORF22 的SNP 位点碱基T ab.2 Bases of SNP sites of ORF22 various re presentative strains of VZV

1.6 酶切位点分析 应用SnapGene 软件寻找测序结果中ORF38-PstⅠ、ORF54-BglⅠ和ORF62-SmaⅠ酶切位点，并与Oka 株（PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ）进行比对，以确认是VZV 野毒株还是疫苗株。

2 结 果

2.1 ORF22 的SNP 及非SNP 位点分析 48 份临床疱疹液DNA 样本与pOka 株的SNP 位点完全一致，为Clade2 基因型。6 份临床疱疹液DNA 样本在非SNP 位点与pOka 株存在差异，4 和47 号样本的37 990 位点由G 替代A，7、18、21、25 号样本的38 059 位点由A 代替C。

2.2 酶切位点分析 48 份临床疱疹液DNA 样本中，有47 份在ORF38（69 349 位）存在PstⅠ酶切位点，记为PstⅠ+，1 份不存在，记为PstⅠ-；48 份于ORF54（95 241 位）存在BglⅠ酶切位点，记为BglⅠ+；48 份于ORF62（106 262 位）不存在SmaⅠ酶切位点，记为SmaⅠ-。因此，47 份临床疱疹液DNA 样本为PstⅠ+BglⅠ+SmaⅠ-，1 份为PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ，均与Oka 株的酶切位点（PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ）不一致，为VZV 野毒株。见图1。

图1 长春市VZV 株ORF38（A）、ORF54（B）、ORF62（C）基因不同酶切位点显示Fig.1 Restriction sites of ORF38（A）、ORF5（B）and ORF62（C）genes of VZV strain in Changchun

3 讨 论

目前，各国对VZV 基因分型的方法较多，其中美国Loparev 根据ORF22 的SNP 位点进行VZV 基因分型的方法成为各实验室VZV 基因主要的分型方式。为防止实验室间因VZV 分型方法的不同而无法进行数据交流与分享，在2008 年英国伦敦举行的VZV 命名会议上，确定了识别VZV 各个进化枝的标准，即基于SNP 的基因分型方案，目前，国际研究小组已确定了Clade1 ～Clade5 5 种VZV 进化枝和Ⅵ、Ⅶ2 种假定分支［9-10］。其中，Clade1 型以Dumas 毒株为代表，主要分布在俄罗斯及部分温带国家或地区；Clade2 型以pOka、Oka 毒株为代表，主要分布在日本、中国、朝鲜半岛、蒙古等亚洲国家；Clade3 型以HJ0、03-500 毒株为代表，主要分布在欧洲地区；Clade4和Clade5 型主要分布在以非洲和赤道附近的热带、亚热带地区［11］。

本研究通过对临床疱疹液样本与基因型代表株的ORF22-SNP 位点进行基因序列比对及基因分型，结果显示，长春市48 份临床疱疹液样本的SNP位点与pOka 株一致，均属于Clade2 基因型，并未发现其他基因型的毒株在长春市范围传播，表明该流行株的VZV 基因序列具有高度保守性。另外，本研究还发现，有6 份样本在非SNP 位点上存在变异，其中2 份于37 990 位点由G 替代了A，4 份于38 059 位点由A 替代了C，多个地区的VZV 流行病学研究也发现了这两个位点的突变［12］，表明该突变在我国境内并非偶然现象。长春市VZV 的流行毒株具有保守性的同时，也具有一定的多态性。

水痘减毒活疫苗在水痘疫情防控过程中起到了至关重要的作用，对流行毒株进行疫苗株和野毒株的区分可以更直观地了解疫苗的有效性、反应性及安全性［13］。本研究结果表明，48 份临床疱疹液样本中，有47 份为PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ，1 份为PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ，与Oka 株PstⅠ-BglⅠ+SmaⅠ比较后发现，均为野毒株感染。所有样本中均存在ORF54-BglⅠ酶切位点，这与欧美的情况有所不同，据美国和英国的调查结果显示，只有19% ～20%临床株存在BglⅠ酶切位点，表明亚洲毒株与欧美毒株存在明显差异。疫苗接种是防控水痘的主要途径［14-18］，在提升疫苗接种率的同时，也应继续做好对VZV 流行株的监测工作，及时掌握本地区VZV 的传播动态，为VZV 的防控提供参考。