外源脯氨酸对自然干旱下白刺叶片气孔的影响

魏 斌 李 毅 苏世平

（甘肃农业大学林学院，兰州 730070）

近年来，随着全球气温不断升高，造成中纬度地区干旱半干旱区域面积逐渐扩大，以致土壤荒漠化速度不断加快。对于荒漠植物来说，水分是影响其正常生长发育最重要的环境因子，而干旱胁迫是植物所遭遇的非生物胁迫之一，当外界环境中的水分不能够维持植物正常生长发育时，植物就会遭受干旱胁迫的影响，因此荒漠植被的繁育已成为干旱半干旱区荒漠化防治的重要手段。对于降水稀少、蒸发量大的干旱半干旱区植物而言，水分的缺失使其面临干旱胁迫。研究表明，干旱胁迫能使植物体内的生理生化反应发生一系列变化，进而导致植物的正常生长发育受到影响，严重时可导致植物死亡。因此，研究荒漠化植物对干旱胁迫的应对机制对荒漠化防治有重要的生态意义。

脯氨酸（Pro）分子量小、水溶性大、对植物细胞无毒副作用，是植物体内最重要的有机渗透调节物质之一，它能够清除植物体内自由基、提高抗氧化物酶保护作用，外源Pro可以提高逆境胁迫下植物的抗氧化能力并促进植物生长，从而提高植物的耐受能力。白刺（）隶属于蒺藜科（Zygophyllaceae）白刺属（），为落叶性灌木，俗称地枣、地椹子、沙樱桃等，广泛分布于我国西北干旱半干旱的荒漠区，是沙漠和盐碱地区重要的耐盐固沙植物。白刺适应环境极强，具有抗旱、喜盐碱、防寒和耐高温等特点，是典型的荒漠化植物，同时又是我国寒温和温和气候地区盐渍土的指示性植物。白刺多生长在干燥、盐碱、多风以及植被较少的严酷环境中。长期生物进化和环境威胁使其逐步形成自身独有的生态防御机制，在形状结构上表现出一些特殊的适应环境变化的特征，如高强等研究表明，在干旱胁迫下，白刺属植物叶片表面积明显缩小且多肉质化，具有较厚的角质层，气孔下陷，叶肉组织均为环栅型，栅栏组织发达，海绵组织特化为贮水组织，输导组织较为发达。白刺抗逆性研究是白刺反应干旱胁迫的形态结构变化的基础。气孔是高等陆地植物的表皮特有结构，是植物与环境气体、水分交换的通道，保卫气孔对环境变化非常敏感，并通过水分的进出调节气孔大小。植物叶片表皮上的气孔是否闭合、分布和对其生长发育过程及其对外部自然环境的生理适应能力是至关重要的。近年来，国内外学者对白刺的研究主要集中在品种选育和鉴定、表型性状评价以及种质遗传多样性、栽培管理技术等，也有学者对白刺抗逆性方面进行了研究，诸如祁迎林等综述了白刺的抗旱性、抗盐碱性、抗风沙性以及它的开发价值，还有学者们在种子、生理、光合特性、群落演化、干旱胁迫等方面进行了大量研究，但对其叶片解剖特征的研究较少且集中在较早时期，但是国内外学者关于外源脯氨酸对白刺叶片气孔的研究鲜有报道。

本研究通过扫描电子显微镜对外源脯氨酸处理过程中的多年生白刺叶表面和叶表皮气孔的变化，系统的观察并研究了白刺叶片对干旱环境的适应性，为探讨白刺的耐旱性和白刺在干旱半干旱地区的改进和植物恢复过程中的利用提供了基础依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

该研究区位于甘肃省武威市林业综合服务中心 的 良 种 繁 育 基 地 羊 下 坝 镇（38°38′N，103°51′E），地处甘肃省河西走廊的东北方向，干旱少雨，蒸发量大，属典型温带大陆性荒漠气候。白刺分布区以天然白刺为主，土壤属碱性沙地，属川区地带，紧靠腾格里沙漠的边缘，平均土壤含水量为0.4%，年均降雨量为113.2 mm，年均蒸发量为2 604.3 mm，年均气温为7.6 ℃，海拔为1 378 m。根据2018 年武威市气象资料显示，武威市2018年上半年气温偏高，降水偏少，上半年平均气温6.2 ℃，较历年同期偏高1.5 ℃；平均降水量71.2 mm，较历年同期偏少30%，5月13—14日出现35 ℃及以上高温，是有气象记录以来年最早出现高温，5—7月整体降水偏少，温度偏高，由此可见，干旱较严重对生态植被的正常生长造成了严重的影响。

1.2 材料来源

本试验所用材料来自武威市林业综合服务中心良种繁育基地，在基地大田环境中选择同一家系、无病虫害、大小长势基本一致的多年生白刺植株作为试验材料并进行处理。

2.5%戊二醛，0.1 mol·L、pH=7.2 的磷酸钠缓冲液，体积分数30%乙醇，体积分数50%乙醇，体积分数70%乙醇，体积分数80%乙醇，体积分数90%乙醇，体积分数95%乙醇，无水乙醇，体积分数100%叔丁醇。

1.3 试验方法

在2018 年4 月1 日—7 月22 日对选定的试验区停止人为浇水，水分来源依靠自然降水。

参照后有丽的方法，于2018 年7 月13 日进行脯氨酸处理，共设置了5 个质量浓度梯度，分别是50 mg·L（P）、100 mg·L（P）、150 mg·L（P）、200 mg·L（P）和250 mg·L（P），以蒸馏水处理作为对照（CK），每处理重复3 次，每个重复10 株白刺，共180株。在天气晴朗，无风，早晨露水散去后用手持式喷雾器均匀地将不同质量浓度的脯氨酸溶液喷洒到白刺植株上，以挂满水珠下滴的喷施部分为止。处理后，如遇降雨，采用塑料棚膜遮挡，防止自然降雨进入试验小区。

参照后有丽的试验方案，以处理当日作为第0 天，处理前首先采集叶片，然后喷施后再进行处理，随后在处理结束后的第1、3、6 和9 天等早晨露水散尽后，采集当年无病虫害成熟的叶片，切取中部并立即将其放入装有2.5%戊二醛固定液的5 mL离心管中。

1.4 扫描电镜样品的制备及观察

（1）固定：用蒸馏水将植株叶片表面冲洗干净，切成适当的小段后迅速置于体积分数2.5%的戊二醛固定液中，用针管抽真空使材料下沉后，装入冰盒，带回实验室置于4 ℃下固定2 d。

（2）脱水和置换：将清洗抽空后的叶片用0.1 mol·L、pH=7.2 的磷酸钠缓冲液彻底清洗3 次，每次15 min，然后用系列乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%）逐级脱水，每级15 min，之后再用体积分数100%乙醇逐级脱水2次，每次20 min，再后用体积分数100%叔丁醇置换2次，每次20 min。

（3）干燥：将处理好的样本用冷冻干燥机干燥2～3 min，并小心取出。

（4）粘样：导电胶带粘在扫描电镜的样品台上，整齐的放置样本叶片，粘贴叶片时注意仅用镊子小心按压叶片四周，不要全叶按压，以免破坏叶片的结构。

（5）喷金：用离子溅射镀膜仪喷镀金属膜，喷镀好的材料放入S-3400N 扫描电子显微镜下进行观察，多找几个视野。

（6）拍照：最后用电镜拍摄，进行数据统计，求出叶片不同质量浓度下不同时间气孔各项指标的平均值。

1.5 数据处理及分析

采用Excel 2010 进行数据计算和作图以及SPSS 21.0 进行方差分析，采用Digital Micrograph软件对白刺叶片的气孔长度，宽度及密度进行测量，计算出气孔的面积，每枚叶片可在显微镜下选择10个独立视野进行统计。各项指标和图像数据等所有数据均为处理后的平均值±标准差。

气孔器面积计算公式：气孔面积=3.14×1/4×（气孔长×气孔宽）

2 结果与分析

2.1 不同脯氨酸质量浓度对白刺叶片表皮细胞的影响

白刺叶表皮上有许多大大小小的气孔，而下表皮气孔密度要比上表皮气孔密度大得多（这是因为上表皮接受的阳光照射温度要比下表皮更高，而且叶片的水分比较容易从表皮上部气孔中散失，而气孔作为植物蒸腾作用水分出入的门户，如果过多的水分蒸发，特别是在夏季，尤其是炎热时期，会使植物萎蔫甚至死亡，所以下表皮气孔会避免这种现象）。这符合荒漠植物气孔分布的特点上多下少，这一特征可以降低植物的蒸腾作用，避免过多的水分在植物体中散失，这是荒漠植物适应其环境的特征。不同脯氨酸质量浓度处理下，与对照组相比均发生了不同程度的变化。白刺植物叶片表皮气孔中蜡质较少，气孔保卫细胞为椭圆或肾形，表面光滑，外缘上有一条同心圆状环绕的白色条纹网状纹饰，气孔为长形或椭圆状，外缘有拱，单层明显，内缘平滑或稍具波状弯曲（见图1）。

图1 未处理（A）和处理（B）的白刺叶片表面Fig.1 Untreated（A）and treated（B）leaf surface of N.tangutorum

在不同脯氨酸质量浓度处理下，白刺叶片表面气孔发生褶皱，褶皱现象并不明显，当脯氨酸质量浓度达到200 mg·L时，气孔就会出现紧闭状态，2个保卫细胞的内壁相连，合口呈线状；当脯氨酸质量浓度达到250 mg·L时，气孔褶皱加重，气孔周围出现少量蜡质；当脯氨酸质量浓度达到150 mg·L时，气孔开张度较小，气孔周围蜡质较多，气孔保卫细胞均出现下陷；当质量浓度达到250 mg·L时下陷较其他质量浓度严重，气孔出现不同程度的皱缩；当脯氨酸质量浓度达到200 mg·L时，皱缩较重；当质量浓度达到100 mg·L时，气孔皱缩较严重，而且气孔下陷微张；当质量浓度达到250 mg·L时，微张较重。

2.2 不同脯氨酸质量浓度处理下气孔长度、宽度及面积的变化

在脯氨酸不同质量浓度处理下，白刺叶片气孔长度、宽度和面积变化均有相似之处，且均低于对照值（见图2～4）。其中，在对照处理过程中，白刺叶片气孔长度、宽度和面积等指标呈下降趋势，仅在第9 天时出现增加；当脯氨酸质量浓度为50 mg·L时，气孔长度整体呈下降趋势，宽度和面积出现先降后升再降的趋势，上述三项指标均在第1天达到最大值；当脯氨酸质量浓度为100 mg·L时，气孔宽度和面积在第6 天时达到最大值；当质量浓度为150 mg·L时，气孔宽度和面积在第3 天均达到最大值，随后呈现下降，而长度出现先降后升再降的趋势；当脯氨酸质量浓度为200 mg·L时，气孔长度出现连续下降，而宽度和面积出现先降后升再降的趋势，面积在第9 天达到最小值；当脯氨酸质量浓度为250 mg·L时，气孔宽度和面积出现先降后升再降的趋势，而气孔长度变化较小。气孔长度在不同质量浓度脯氨酸处理下第1、6 和9 天存在显著差异（<0.05），其中第1 天和第6 天均以50 mg·L时最大，250 mg·L时最小，而第9天则以CK 最大，250 mg·L最小；而气孔宽度和面积差异不显著（>0.05）。

图2 不同脯氨酸质量浓度处理下气孔长度的变化Fig.2 Variations of stomatal length under different proline concentrations

图3 不同脯氨酸质量浓度处理下气孔宽度的变化Fig.3 Variations of stomatal width under different proline concentrations

图4 不同脯氨酸质量浓度处理下气孔面积的变化Fig.4 Variations of stomatal area under different proline concentrations

2.3 不同脯氨酸质量浓度处理下气孔密度的变化

在不同脯氨酸质量浓度处理过程中，白刺叶片气孔密度高于对照。当脯氨酸质量浓度为50 mg·L时，气孔密度会先升高后降低再升高，第3天最小值是65 个·mm；当质量浓度达到100 mg·L时，密度的变化趋势是缓慢上升；当脯氨酸质量浓度为150 mg·L时，气孔密度首先下降，第6 天的气孔密度是最小的，第9 天气孔密度达到最大值，为155个·mm，上升幅度骤然；当脯氨酸质量浓度为200 mg·L时，密度变化不明显；当脯氨酸质量浓度为250 mg·L时，第1 天密度达到最大值（见图5）。另外，植物叶片气孔器分布在上下表皮，同时由2 个保卫细胞构成，不同程度的凹陷，有明显气室。除第0天外，气孔密度因脯氨酸质量浓度不同均差异显著，其中第1 天其值以50 mg·L最大，CK 最小，第3 天以CK 最大，50 mg·L最小，第6天以100 mg·L最大，150 mg·L最小，第9 天以150 mg·L最大，250 mg·L最小，第9天脯氨酸质量浓度为250 mg·L时气孔面积最小，较小的气孔可以帮助提高植物的抗旱能力和水分利用效率，其多分布于下表面，既能保证植物与外界环境的气体交换，又能有效抑制水分的蒸腾，从而提高了水分的利用率，而气室中温度较高，抑制叶肉细胞向大气蒸腾失水，同时，当植物叶片单位面积的气孔数目较多时也有利于增加气体的交换，在土壤水分能够供应充分时，提高了土壤光合作用效率，而当一年旱季即将来临时，植物通常会以抑制落叶或者防止气孔关闭对的一种方法大幅减少水分蒸发，从而大幅降低土壤水分。

图5 不同脯氨酸质量浓度处理下气孔密度的变化Fig.5 Variations of stomatal density under different proline concentrations

3 讨论

气孔通过控制植物与外界的气体和水分交换来适应复杂多变的环境。植物既可以短期调节气孔开度又可以长期控制气孔发育和形态来适应环境的变化。

本研究采用扫描电子显微镜对自然干旱胁迫下不同外源脯氨酸质量浓度处理下的多年生荒漠植物白刺叶片进行微观结构的观察与分析，观察发现，白刺叶片表皮气孔保卫细胞为肾形，气孔在叶片表皮随机分布，气孔器多为无规则型，气孔呈椭圆形且叶片表面蜡质较少，并且叶片细胞出现褶皱和下陷，另外，上下表皮均有气孔分布，为双面气孔分布型，这样有利于荒漠植物更好的利用蒸腾作用降低植物自身温度，减少灼伤。此外，随着脯氨酸质量浓度的增大和处理时间的延长，多年生植物白刺气孔密度表现出增加的趋势，而气孔长度、宽度和面积则表现出下降的趋势，干旱胁迫下，植物气孔长度和宽度下降趋势具有同步性。当脯氨酸质量浓度为50 mg·L，处理第3 天时，可能是因为适度的质量浓度有利于气孔的开张，对气孔密度影响不大；而在100 mg·L第6 天时，气孔密度明显变大，可能是因为干旱环境影响了细胞的伸长，导致气孔叶面积变小，进而提高了单位面积上气孔数量。有研究表明，气孔数越多，越有利于植物通过蒸腾作用散失热量，从而避免植物叶片因为温度过高使得叶绿体和原生质变性。得叶片具有保水作用。在脯氨酸质量浓度为200 mg·L第6 天时，气孔密度下降到与对照接近，但仍高于对照，可能是由于质量浓度过大，胁迫程度加重，植物光合作用受到较大影响，减少了植物的能量供应，然而，各质量浓度下气孔密度均高于对照，这可能是因为干旱导致白刺叶片萎蔫，引起所测单位气孔数量增加，密度也增加，这与李伟等研究的结果是一致的。同时，气温也能影响植物气孔的大小、密度，本研究中，在处理第3～9 天时气温相对较高，可能是由于温度适宜植物叶片的生长，CK第9天的气孔长度、宽度和面积明显高于第3和6天。

对于生长在干旱半干旱区的植物来说，叶片气孔作为植物与外界环境进行水分和气体交换的重要场所并且叶片具有较强的敏感性和可塑性，因此可以适应变化多端的环境，它可以与外界环境直接接触，通过对其叶片进行微观结构的解剖观察来响应逆境环境。当土壤缺水严重，水分蒸发较高时，气孔的关闭可以缓解水分散失，这也是防止植物受害的一种重要的生理机制。通常可以用叶片气孔密度和大小的变化来分析植物对干旱环境的响应。同时，白刺叶肉质，密生于嫩枝，簇生，倒卵形长椭圆状，先端钝、全缘，电镜下可观察表皮分泌许多盐粒，被单细胞表皮毛覆盖，长度较短，属柔毛，其表皮毛能够防止日灼，同时还能够保护叶肉细胞，并在气孔打开时起保护作用，减少水分的蒸腾。尤其是表皮毛死亡后，可在叶表面形成一层厚的护栏，在气孔周围形成湿润小环境，叶片表皮细胞形状比较规则，近四边形，排列紧密。Bosabalidis等研究表明，密集的表皮细胞及其平直的细胞壁，可以有效阻止由于水分的缺失导致干旱环境下细胞的破裂。植物的响应能力和自身生化机制都有一定的反应能力，可以通过其自身的形态变化和生理的生化反应，适应持续变化的环境。白刺叶表皮呈蜡质，经不同脯氨酸质量浓度的处理，不仅可以减少水分的散失，而且还可以对植物体有一定的保护作用。叶表面存在的蜡质形态特征，可以被解释为水分的平衡，因为蜡质有保水功能可以减少非气孔蒸腾的作用，从而防止水分的流失。

植物内部叶表面的主要气孔通道是与植物外部环境之间发生大量气体、水分空气交换相互关系的主要空气通道，直接起到影响水生植物空气蒸腾的生理作用，对指导植物进行光合、呼吸和生理蒸腾等各种生理化学活动及其发展过程具有重要指导作用。因此气孔调节是植物抵御干旱和适应生态环境的机制之一。白刺叶片的气孔长度、宽度与气孔关系密切，两保护细胞的距离变大，气孔开度增大，距离变短，气孔开度减小甚至关闭，不利于植物的光合作用。在气孔的长度变化过程中，整体呈下降趋势，这表明脯氨酸质量浓度的增大，从而降低了气孔的开度，这是由于植物降低了气孔的开度，从而减少了蒸腾的作用，缓解水分的缺失达到抗旱的效果。气孔宽度整体呈现先降低后升高再降低的趋势，当脯氨酸质量浓度达到100 mg·L时，升高幅度有所增加，之后又下降，表明气孔有自我调节的能力，可以缓解植物细胞在高质量浓度下缺水的能力。气孔的面积与气孔的宽度变化趋势相似，而在第6 和9 天时，随着脯氨酸质量浓度的升高，虽然气孔面积已经变小，但气孔依然呈张开状态，这说明在高质量浓度下的植物细胞，虽然缺水但仍有相当强的渗透调节能力，但也有一项研究发现，气孔密度并不随着干旱程度的加剧而一直升高，而是先升高后下降，此时，白刺叶片表现出较强的抗旱能力。

4 结论

植物个体叶表面内部表皮的气孔开闭系统是控制植物与个体外部环境之间的内部气体相互交换的主要通道，控制器是蒸腾器的结构，通过其中的开闭气孔可以实时控制各种植物内部气体的相互交换速率和植物水分的蒸腾，对控制植物个体生长发育过程起着非常重要的控制作用。通过扫描电镜观察可以清楚的看到，在不同脯氨酸质量浓度处理下白刺叶表面的气孔形状特征表现形式为：叶片表面有蜡质出现，且主要表现为随着质量浓度的升高蜡质反而减少，气孔周围也出现褶皱现象，同时也伴随着气孔下陷。

与对照相比，在不同质量浓度处理和不同采样时间下，气孔长度、宽度及面积下降，气孔密度增大，其中，气孔长度、宽度和面积均在脯氨酸质量浓度为50 mg·L，采样第1 天时出现最大值，气孔长度在不同质量浓度脯氨酸处理下第1、6 和9天存在显著差异，而气孔宽度和面积差异并不显著。气孔密度则在脯氨酸质量浓度为150 mg·L，采样第9 天时达到最大值，除第0 天外，气孔密度因脯氨酸质量浓度不同均差异显著，还可能与其他环境因子的干扰有关。此外，气孔长度在质量浓度为250 mg·L，采样第9 天时出现最小值，宽度在质量浓度为150 mg·L，采样第6 天时达到最小值，而面积在质量浓度为150 mg·L，采样第6和9天时变化不明显，密度在质量浓度为150 mg·L，采样第9天时上升幅度骤增。

综上，在自然干旱胁迫下，对白刺叶面喷施不同质量浓度的脯氨酸，可减少气孔长度、宽度和面积，增加气孔密度。这与高建平等得出的结论相一致，进而可以缓解干旱对白刺植株造成的损伤。