不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦H2S产生和活性氧代谢的影响

刘建新 刘瑞瑞 刘秀丽 贾海燕 卜 婷 李 娜

（甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室/陇东学院生命科学与技术学院，庆阳 745000）

裸燕麦（L.）是禾本科（Poaceae）燕麦属（）一年生粮草兼用型作物，其籽粒含15.6%蛋白质和8.8%脂肪，且富含矿物质、膳食纤维、黄酮和皂苷等成分，具有营养和降低血糖、血清胆固醇等保健功效。裸燕麦起源于中国，在植物分类上是燕麦属一个独立的栽培种。我国栽培裸燕麦已有2 500多年，主要分布在西北、华北和西南等地的高海拔冷凉地带，年种植面积约55 万hm。中国西北盐渍化土壤广泛分布，随着气候变暖和生产中长期偏施化肥，土壤盐碱化程度日趋加剧，严重影响裸燕麦生长发育和产量提升。盐碱胁迫下，植物矿质离子失衡和光合作用受阻，活性氧（ROS）积累，生理代谢紊乱和生长受抑。

硫化氢（hydrogen sulfide，HS）是植物中发现的第3 种气体信号，它参与植物多种生理过程，并在植物抵抗干旱、高温、冷害和重金属等逆境响应中发挥着重要作用。HS 能够增强植物耐受盐碱胁迫的能力，如NaCl 胁迫下，HS 通过提高大麦（）质膜和液泡膜H-ATP酶转录和液泡Na/H逆向转运体表达及调控小麦（）非选择性阳离子通道（NSCCs）和盐超敏感（SOS1）通路维持Na、K稳态。外源HS 通过上调抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）循环维持盐胁迫下玉米（）体内AsA 和GSH 氧化还原状态；通过提高抗氧化水平降低盐胁迫诱导的ROS 积累对茶树（）细胞膜的氧化损伤；改善盐碱胁迫对垂丝海棠（）光合功能的抑制；缓解盐胁迫对番茄（）PS Ⅱ的伤害；提高盐胁迫下小麦抗氧化防御系统活性。这些研究表明，外施HS 不仅可维持Na、K稳态，还可通过调控ROS代谢增强植物对盐碱胁迫的耐性。但这些研究多以单一NaCl胁迫下的植物幼苗为研究对象，缺乏根据作物种植地土壤盐碱组成，在不同生育时期施用HS 对植物生理响应调节效应的研究。本试验模拟甘肃省中部裸燕麦种植地盐碱含量和成分，采用盆栽土培试验探讨裸燕麦不同生育时期喷施不同浓度HS 供体硫氢化钠（NaHS）对内源HS 产生和ROS 代谢的调控作用，旨在从抗氧化防御角度筛选最佳的HS 喷施时期和喷施浓度，为西北裸燕麦抗盐碱栽培管理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2020 年3 月至8 月在甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室生物科技园进行。供试裸燕麦品种‘定莜号9’种子购自甘肃省定西市农业科学研究院；试验所用NaHS、NaCl、NaSO、NaCO和NaHCO购自上海生工生物工程技术服务有限公司。供试土壤采自黄土高原董志塬庆阳市（35°36′45″N，107°34′43″E），土壤类型黑垆土，质地粉砂壤。取耕作层（0～20 cm）土风干、打碎，过5 mm 筛。土壤基本理化性状为pH 7.89，有机质11.88 g·kg，全氮（N）0.785 g·kg，全磷（PO）0.601 g·kg，全钾（KO）18.56 g·kg，碱解氮38.74 mg·kg，速效磷（PO）6.79 mg·kg，速效钾（KO）176.8 mg·kg，土壤电导率（EC）3.3 mS·cm。

1.2 试验设计

采用喷施时期和NaHS 浓度双因素试验设计。喷施时期设幼苗期、拔节期、抽穗期、开花期、灌浆期5 个水平；NaHS 浓度设0、25、50、100、200、400 μmol·L6 个水平，共30 个处理。试验用塑料盆口径为31.5 cm，底径25.0 cm，高34.0 cm，配有底托以便渗水返回盆中。模拟甘肃省中部裸燕麦主栽区土壤含盐量和盐碱组成，按土壤含盐量3.00 g·kg，按摩尔比（NaCl）∶（NaSO）∶（NaCO）∶（NaHCO）=12∶8∶1∶9 复配混合，与18.0 kg 风干土（含水量2.02%）混匀，再拌入4 L 有机草碳基质（有机质≥45%，育鑫丰基质有限公司）、复合肥（N-PO-KO=13-17-15，山东联盟磷肥有限公司）0.50 g·kg和微生物菌肥（山东土秀才生物科技有限公司，有效活菌数≥10 亿·g）14.1 g·kg后 装 盆，按 田 间 持 水 量75%浇水平衡和沉实3 d 后播种裸燕麦（2020 年3月26 日），每盆播70 粒种子（0.2%多菌灵拌种12 h），播后覆土3 cm。4 月22 日间苗和疏苗，5 月4日每盆定苗25 株。整个生育期叶面追施2 次0.2% KHPO（5 月28 日和6 月14 日），常规管理。分别在裸燕麦幼苗期（5 月24 日）、拔节期（6 月9日）、抽穗期（6 月14 日）、开花期（6 月25 日）、灌浆期（6 月30 日）叶面喷施0、25、50、100、200、400 μmol·LNaHS。每盆为1 个重复，重复5 次，随机排列。早晚各喷施1 次，连喷3 d，喷施量每盆40 mL，喷施液含0.01%吐温−80 以提高叶面黏附性。各时期最后1 次喷施后第72 h 剪取倒2 叶用液氮速冻超低温冰箱−70 ℃保存，测定相关指标。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 HS 含量和-半胱氨酸脱巯基酶（LCD）活性测定

HS含量测定参考高晓兰等方法进行修改：取1.0 g 叶片，加入3.0 mL 预冷的100 mmol·L磷酸钾缓冲液（pH7.4，内含10 mmol·LEDTA 和0.25%醋酸锌）和少许石英砂，研磨，再用2.0 mL磷酸钾缓冲液转移匀浆至离心管，离心15 min（4 ℃，12 000×），取上清液2.4 mL，加入0.3 mL 5 mmol·LN，N-二甲基对苯二胺，摇匀，加入0.3 mL 50 mmol·LFeCl摇匀15 min，在667 nm 下测定吸光度。以NaS 建立标准曲线，计算HS 含量。LCD 活性按Chen等的方法测定。

按陈建勋等的方法测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性；谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定参照FOSTER 等的方法。AsA 含量测定用二联吡啶比色法；GSH 含量测定用二硫二硝基苯甲酸法。

1.4 数据统计分析

所有数据以单位鲜质量材料为基础计算结果，用Micorsoft Excel 2007 整理；采用SPSS 20.0 软件进行方差分析和Duncan 法多重比较（显著性水平0.05），结果以平均值±标准差表示。为综合反映不同时期喷施NaHS的效应，参考刘建新等方法计算不同处理的隶属函数综合评价值（）。

2 结果与分析

2.1 不同时期喷施NaHS 对盐碱胁迫下裸燕麦叶片H2S含量的影响

从表1 可见，与喷施0 μmol∙LNaHS 相比，在幼苗期喷施50、100、200 μmol∙LNaHS 的裸燕麦叶片HS 含量显著提高，喷施25 和400 μmol∙LNaHS 的HS 含量差异不显著；拔节期喷施100、200、400 μmol∙LNaHS 显著提高HS 含量，喷施25、50 μmol∙LNaHS的HS含量与喷施0 μmol∙LNaHS 的差异不显著；抽穗期喷施不同浓度NaHS不 同 程 度 提 高 了HS 含 量，其 中50、100、400 μmol∙LNaHS 处理的HS 含量差异显著；开花期喷施不同浓度NaHS 的HS 含量不同程度降低，除200 μmol∙LNaHS 处理的HS 含量差异不显著外，其余浓度NaHS 处理的HS 含量差异均有统计学意义；灌浆期喷施不同浓度NaHS 显著提高了HS含量，其中喷施100 μmol∙LNaHS 的HS含量最大，提高了95.4%。

表1 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片H2S含量的影响Table 1 Effects of spraying NaHS in different periods on H2S content of naked oat leaves under saline-alkali stress

2.2 不同时期喷施NaHS 对盐碱胁迫下裸燕麦叶片LCD活性的影响

LCD 是植物体内催化-半胱氨酸脱巯基产生HS 的关键酶。表2 显示，与喷施0 μmol∙LNaHS 相比，幼苗期喷施25～400 μmol∙LNaHS 后裸燕麦叶片LCD 活性呈先升后降趋势，50、100、200 μmol∙LNaHS 处理显著提高了LCD 活性；拔节期的LCD 活性随NaHS 喷施浓度提高亦呈驼峰变化，其中100 μmol∙LNaHS 处理的LCD 活性最大；抽穗期的LCD 活性随NaHS浓度提高呈升—降—升变化，100 μmol∙LNaHS 处理下LCD 活性最大；开花期喷施NaHS降低了LCD活性，在NaHS喷施浓度为25～400 μmol∙L范围内LCD活性呈先升后降变化，其中200 μmol∙LNaHS 处理的LCD 活性最高；灌浆期LCD 活性随NaHS喷施浓度增大呈双峰曲线变化，其中喷施100 μmol∙LNaHS 的LCD 活性最高，喷施25 μmol∙LNaHS 的LCD 活性次之。

表2 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片LCD活性的影响Table 2 Effects of spraying NaHS in different periods on LCD activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

2.3 不同时期喷施NaHS 对盐碱胁迫下裸燕麦叶片−.O2 、H2O2和MDA含量的影响

2.4 不同时期喷施NaHS 对盐碱胁迫下裸燕麦叶片SOD、CAT、POD和APX活性的影响

表6～9 表明，与喷施0 μmol∙LNaHS 相比，幼苗期喷施50 μmol∙LNaHS 显著降低了SOD 活性；25 μmol∙LNaHS 处理提高了CAT 和POD 活性，50、200 和400 μmol∙LNaHS 处理显著降低了CAT 活性，100、200 和400 μmol∙LNaHS 处理显著降低了POD 活性，400 μmol∙LNaHS 处理显著提高了APX 活性。拔节期喷施25 μmol∙LNaHS降低了SOD 活性，喷施400 μmol∙LNaHS 提高了SOD 活性；但喷施25～400 μmol∙LNaHS 的CAT活性与喷施0 μmol∙LNaHS 的差异不大，喷施100 μmol∙LNaHS 的POD 活性显著升高；喷施50～400 μmol∙LNaHS 的APX 活性显著下降。抽穗期喷施50 μmol∙LNaHS的SOD活性降低，CAT活性提高，喷施200 μmol∙LNaHS 的CAT 活性下降；喷施25～400 μmol∙LNaHS 的POD 和APX 活性变化不大。开花期喷施25 μmol∙LNaHS 显著降低了SOD 活性；喷施25～400 μmol∙LNaHS 未显著改变CAT 和POD 活性，显著提高了APX 活性。灌浆期喷施25、50、200 μmol∙LNaHS的SOD活性显著低于喷施0 μmol∙LNaHS；但25～400 μmol∙LNaHS 处理的CAT 和POD 活性没有发生显著改变，50、100 μmol∙LNaHS处理显著提高了APX活性。

表3 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片O−2. 含量的影响Table 3 Effects of spraying NaHS in different periods on O−2. content of naked oat leaves under saline-alkali stress

表4 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片H2O2含量的影响Table 4 Effects of spraying NaHS in different periods on H2O2content of naked oat leaves under saline-alkali stress

表5 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片MDA含量的影响Table 5 Effects of spraying NaHS in different periods on MDA content of naked oat leaves under saline-alkali stress

表6 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片SOD活性的影响Table 6 Effects of spraying NaHS in different periods on SOD activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

表7 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片CAT活性的影响Table 7 Effects of spraying NaHS in different periods on CAT activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

表8 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片POD活性的影响Table 8 Effects of spraying NaHS in different periods on POD activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

表9 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片APX活性的影响Table 9 Effects of spraying NaHS in different periods on POD activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

2.5 不同时期喷施NaHS 对盐碱胁迫下裸燕麦叶片AsA、GSH含量和GR活性的影响

AsA 和GSH 两种抗氧化物质可直接或通过AsA-GSH 循环清除ROS，而GR 在维持AsA、GSH氧化还原平衡中起关键作用。表10～12 表明，与喷施0 μmol∙LNaHS 相比，幼苗期喷施50、100 μmol∙LNaHS 显著降低了AsA 含量，却不同程度提高了GSH含量，喷施25、200、400 μmol∙LNaHS的GR活性显著提高。拔节期喷施50 μmol∙LNaHS提高了AsA 含量，喷施25～400 μmol∙LNaHS 没有改变GSH 含量和GR 活性。抽穗期喷施25～400 μmol∙LNaHS 均可不同程度提高AsA 含量；但没有显著影响GR 活性；喷施25 μmol∙LNaHS 降低了GSH 含量，喷施400 μmol∙LNaHS 提高了GSH含量。开花期喷施25 μmol∙LNaHS 显著降低了AsA含量；喷施50～400 μmol∙LNaHS不同程度提高了GSH 含量和GR 活性。灌浆期喷施25～400 μmol ∙LNaHS 的AsA 含 量 与 喷 施0 μmol ∙LNaHS 无显著差异；但100 和400 μmol∙LNaHS处理的GSH 含量显著下降；喷施100 μmol∙LNaHS的GR 活性显著提高。其他浓度NaHS 处理的AsA、GSH 含量和GR 活性与0 μmol∙LNaHS 处理的差异无统计学意义。

表10 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片AsA含量的影响Table 10 Effects of spraying NaHS in different periods on AsA content of naked oat leaves under saline-alkali stress

2.6 喷施时期和NaHS浓度对裸燕麦H2S产生和ROS代谢的双因素方差分析

2.7 不同时期喷施NaHS 对盐碱胁迫下裸燕麦H2S产生和ROS代谢的隶属函数综合评价

从图1 可知，喷施时期和NaHS 浓度对裸燕麦上述指标的值有显著影响。在幼苗期喷施200和25 μmol∙LNaHS可显著提高值；拔节期喷施200 μmol∙LNaHS 的值显著升高；抽穗期喷施25～400 μmol∙LNaHS 的值与喷施0 μmol∙LNaHS 的值无显著差异；开花期喷施50、100、200 μmol∙LNaHS 显著提高值，其中50 μmol∙LNaHS 的值最大，喷施400 μmol∙LNaHS 的值差异不显著；灌浆期喷施50、100 μmol∙LNaHS的值显著提高，喷施25、200、400 μmol∙LNaHS的值与0 μmol∙LNaHS处理无显著差异。

图1 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦隶属函数综合评价值（D）的影响不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）Fig.1 Effects of spraying NaHS in different periods on comprehensive evaluation value of membership function（D）for naked oat under saline-alkali stress Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at the 0.05 level

表11 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片GSH含量的影响Table 11 Effects of spraying NaHS in different periods on GSH content of naked oat leaves under saline-alkali stress

表12 不同时期喷施NaHS对盐碱胁迫下裸燕麦叶片GR活性的影响Table 12 Effects of spraying NaHS in different periods on GR activity of naked oat leaves under saline-alkali stress

表13 NaHS喷施浓度和喷施时期对裸燕麦H2S产生和活性氧代谢的双因素方差分析结果Table 13 Two-way analysis of variance for spraying periods and NaHS concentrations on H2S production and active ox‐ygen metabolism of naked oat

3 讨论

HS在植物体内具有多种生成途径，以-半胱氨酸为底物由LCD 催化的HS 产生是其主要的合成途径。HS 作为气体信号可自由穿过细胞膜进入细胞与相应靶分子结合，快速高效参与调控植物生长发育等生理过程以及缓解干旱、盐害、高温、冷害和重金属等逆境带来的氧化损伤。周超凡等指出，外源NaHS 促进黄瓜（）受低温胁迫诱导的LCD催化HS的合成，并通过增强活性氧清除能力减轻低温引起的光合机构损伤。吴延朋等研究表明，盐胁迫下拟南芥（）体内HS合成相关酶L/D-CD 活性及HS含量显著升高。本研究结果显示：在盐碱混合胁迫下，不同时期喷施NaHS 可引起裸燕麦叶片中HS含量和LCD活性发生显著改变（见表1～2）；幼苗期以喷施50 μmol∙LNaHS的HS含量和LCD活性最高；拔节期、抽穗期和灌浆期以喷施100 μmol∙LNaHS 的HS 含量和LCD 活性最大；开花期喷施25～400 μmol∙LNaHS使HS 含量和LCD 活性不同程度下降。说明一定时期喷施适宜浓度NaHS 可诱导盐碱胁迫下裸燕麦体内由LCD 催化的HS 生成。这与高晓兰等的外施NaHS可诱导桃（）实生苗体内HS合成的结果类似。因此，在裸燕麦幼苗—抽穗期和灌浆期喷施50～100 μmol∙LNaHS 能够有效提高体内HS含量。

外源HS对盐碱胁迫下裸燕麦内源HS的产生和ROS 代谢的影响随NaHS 施用时期和喷施浓度而发生变化，是ROS清除系统成员分工协同相互作用的结果，通过隶属函数分析可综合反映ROS代谢对外源HS 的响应。本试验以12 个HS 生成和ROS代谢相关指标的隶属函数分析表明：喷施时期和NaHS浓度及二者的交互作用对D值存在显著影响；Duncan 法测验显示，在幼苗期喷施25、200 μmol∙LNaHS及拔节期喷施200 μmol∙LNaHS 的D值显著高于其它时期喷施其他浓度NaHS的D值（见图1）。可见，从ROS代谢的角度来考察，以裸燕麦幼苗期和拔节期喷施25～200 μmol∙LNaHS 更能有效促进内源HS生成和维持ROS代谢平衡。

4 结论

致谢 感谢2017级生物技术班王婷、刘秀龙、景鼎鼎和王剑同学在指标检测和数据分析中所做的大量工作。