狼疮性肾炎患者血浆巨噬细胞集落刺激因子表达水平及其临床意义

崔艳，齐媛媛，刘欣冉，赵亚飞，赵占正

（郑州大学第一附属医院 肾内科，河南 郑州 450052）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种全身性自身免疫性疾病，多发生于育龄期女性，病变可累及全身各个系统或器官。肾是SLE最主要累及的器官之一，其受累也是SLE患者生活质量受到影响以及死亡的最主要原因［1-2］。狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是我国较为常见的继发性肾病，约90%以上的SLE患者均有不同程度的肾损害，10%～30%的患者可能会进展至终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）［3］。目前，肾穿刺活检术仍然是诊断SLE肾损害的金标准，但是其具有一定的风险。因此，寻找一种能够及时预测LN发生的新型生物标志物对于改善患者预后具有重要意义。巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，MCSF）是一种主要负责巨噬细胞的生存、增殖和活化的细胞因子，既往已有研究证实活化的促炎性巨噬细胞可能会促进SLE患者发生肾损害，并且还会加重LN的病情［4］。作为其激活过程中必不可少的细胞因子，之前也有研究显示血清MCSF水平在SLE患者中升高，并且与疾病的活动性有关［5］。本研究通过对SLE是否合并肾损害进行严格筛选，探讨MCSF在SLE患者不合并肾损害与合并肾损害中的表达差异及其与临床指标的相关性，从而进一步验证MCSF是否可作为预测LN的发生以及病情进展的一种可靠的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 研究对象本研究为一项横断面研究。选取2019年9月至2020年1月就诊于郑州大学第一附属医院的SLE患者。SLE合并肾损害的判断依据美国风湿病学会制定的肾损害标准［6］，即：24小时尿蛋白定量持续≥0.5 g或尿蛋白定性≥+++或尿中有细胞管型；持续存在尿蛋白与肌酐比值（urinary protein to creatinine ratio，uPCR）≥0.5；排除感染后仍存在活动性尿沉渣；肾穿刺活检证实有肾损伤的存在。为确保结果的可靠性，本研究为不合并肾损害的SLE患者制定了严格的入组标准，如有以下任意一项则被排除：（1）尿蛋白定性≥+；（2）24小时尿蛋白定量或uPCR高于正常范围上限；（3）排除尿路感染后，仍合并血尿、脓尿或管型尿；（4）血肌酐（serum creatinine，Scr）高于正常范围上限。最终，本研究收集的血浆样本共来自76例患者，根据是否合并肾损害分为SLE组（16例）和LN组（60例）。同时，招募了21例健康志愿者作为对照组。98例全血样本来自待测血浆样本的试验对象（SLE组16例，LN组53例，对照组21例）以及新纳入组的8例（SLE 1例，LN 4例，对照者3例），故全血样本共包括：SLE组17例，LN组57例以及对照组24例。7例LN患者肾组织标本取自在郑州大学第一附属医院肾内科接受肾穿刺活检术的患者，4例对照组标本取自在郑州大学第一附属医院泌尿外科接受手术治疗的肾癌患者的远端正常肾组织。本研究已获得郑州大学第一附属医院医学伦理委员会的批准（伦理获批编号：2019-KY-134）。所有入组的试验对象均同意本研究对样本的采集与处理，并签署知情同意书。

1.2 一般资料收集入选人群的性别、年龄等人口学资料，SLE患者的临床表现，如面部红斑、关节炎、浆膜炎等，实验室资料，包括收缩压（systolic blood pressure，SBP）、舒张压（diastolic blood pressure，DBP）、血白细胞计数、血淋巴细胞计数、血小板计数（platelets，PLT），uPCR、尿素、Scr、尿酸（uric acid，UA）、估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、血清补体C3及C4水平、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C反应蛋白、抗dsDNA抗体等。同时收集所有接受过肾穿刺活检术的LN患者的病理分型、活性指数（activity index，AI）及慢性指数（chronic index，CI）。SLE活动性评分依据2000年系统性红斑狼疮活动指数（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）评分标准。

1.3 试验方法

1.3.1 血浆MCSF测定 抽取76例入组患者及21例健康人的外周静脉血5 mL，装于EDTA-K2抗凝管内，分离出血浆样本后密封冻存于-80℃冰箱内。应用人细胞因子芯片定量检测试剂盒（Raybiotech）检测所有血浆样本的MCSF水平。

1.3.2 全血及肾组织MCSF mRNA表达测定 抽取74例患者及24例健康人的外周静脉血，使用TRIzol试剂（Life Technologies）从全血样本中分离和提取总RNA，并且应用PE150（Illumina，San Diego，CA，USA）进行全基因组RNA测序实验（RNA sequencing，RNAseq）以检测全血MCSF mRNA的表达水平。此外，利用RNA-seq技术分别检测7例LN患者肾组织标本及4例对照组肾组织标本中MCSF mRNA的相对表达水平。

1.4 统计学方法采用SPSS 25.0统计软件对试验数据进行统计分析。计数资料用频数和百分数（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；符合正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的计量资料用中位数及四分位数［M（P25，P75）］表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。血浆MCSF水平与疾病活动性及肾功能等的相关性采用Spearman相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料特点本研究共纳入16例不伴肾损害的SLE患者、60例LN患者及21例对照者用于分析血浆MCSF水平的表达差异。3组中女性占比分别为87.5%、88.3%和66.7%，年龄中位数分别29.5、30和25岁。相对于SLE组，LN组患者面部红斑发生率稍低，血压、尿素、Scr及UA水平较高，血清白蛋白和eGFR水平较低（P＜0.05）。两组其他资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 患者的一般资料

2.2 血浆MCSF表达水平LN组、SLE组及对照组血浆MCSF水平分别为0.44（0～3.64）、0（0～0.44）ng·L-1及0。与SLE组及对照组相比，LN组血浆MCSF表达水平较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。SLE组与对照组血浆MCSF表达水平相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 3组血浆MCSF表达水平比较

2.3 血浆MCSF水平与LN临床表现及实验室指标的相关性LN组患者血浆MCSF水平特异性升高，以LN患者中血浆MCSF水平的中位数0.439为界，将LN患者分为两组，即高血浆MCSF组和低血浆MCSF组。与低血浆MCSF组相比，高MCSF组LN患者的浆膜炎发生率更高（P＝0.028），高MCSF组患者的PLT水平、血清C3及C4水平较低，且高MCSF组患者的基线肾功能较差，即血尿素氮、Scr水平较高，eGFR水平较低，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组关节炎发生率及血淋巴细胞、血清UA、ESR、C反应蛋白以及抗dsDNA抗体水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究共收集到60例LN患者的肾穿刺病理结果，两组膜型（Ⅱ或Ⅴ型）、增殖型（Ⅲ或Ⅳ型）、混合型（Ⅴ、Ⅲ型或Ⅴ、Ⅳ型）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。采用Spearman相关性分析进一步研究血浆MCSF水平与LN患者部分指标的相关性，结果显示，血浆MCSF水平与LN患者发生浆膜炎有关，即血浆MCSF水平越高，LN患者发生浆膜炎的可能性越大（P＝0.032）。LN患者血浆MCSF水平与PLT、C3、C4水平呈负相关（r＜0，P＜0.05），与SLEDAI评分（r＞0，P＜0.05）呈正相关；血浆MCSF水平与LN患者uPCR、血尿素、Scr呈正相关（r＞0，P＜0.05），与eGFR呈负相关（r＜0，P＜0.05）。见表3。

表2 高MCSF组与低MCSF组临床表现及实验室指标比较

表3 LN患者MCSF水平与临床指标相关性分析

2.4 全血及肾组织MCSF mRNA表达差异LN组全血MCSF mRNA的相对表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＝0.040）。LN组与SLE组以及SLE组与对照组的MCSF mRNA相对表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。另外，与对照组相比，LN组肾组织MCSF mRNA的相对表达水平较高（P＝0.006）。见图2。

图2 全血及肾组织MCSF mRNA相对表达差异比较

3 讨论

LN是我国较为常见的继发性肾病，也是ESRD主要病因之一。肾炎症反应的发生也是LN发病的重要原因之一［7］。正常情况下，机体巨噬细胞作为人体固有免疫重要组成部分，主要发挥吞噬异物及死亡细胞、清除有害物质等生理作用以维持人体免疫系统的稳定。而在机体炎症反应状态下，被异常激活的肾内巨噬细胞则介导肾损害的发生和病情的持续进展［8-9］。已有研究证实，巨噬细胞参与了SLE的病理过程，且异常增殖活化的巨噬细胞可以促进MRL-Faslpr大鼠疾病进展［10-11］。MCSF是一种参与巨噬细胞增殖、活化的重要的细胞因子。早期识别SLE患者肾损害的发生对延缓病情进展、改善肾预后具有重要意义［12］。但是，作为一项有创性操作，临床肾穿刺活检术可能会因为患者合并其他合并症、费用高昂或患者个人原因不能有效配合而无法顺利实施。因此，仍需要一些新型且可靠的生物标志物用于监测SLE患者肾损害的发生及疾病活动性。

本研究检测了MCSF在SLE及LN患者中的表达水平，详细研究了MCSF与SLE合并LN患者病情活动性及严重性的相关性。与之前研究结果［5，13］一致，本研究显示LN患者血浆MCSF水平升高。研究表明，MCSF主要表达于肾小管内皮细胞，当肾发生炎症反应时，肾内MCSF表达增加导致肾间质内巨噬细胞大量聚集、活化，并向促炎型转化，从而引起肾损伤，同时肾内增加的MCSF也会释放入血，引起循环MCSF水平升高［14-15］。此外，本研究结果显示，血浆MCSF水平与LN患者血小板水平、血清补体水平以及SLEDAI评分都有相关性。既往研究表明，血清补体水平与SLE患者病情活动有关［16］，而SLEDAI评分是临床上常用来评价SLE病情活动程度的指标。病情持续高活动状态是SLE患者死亡及并发不可逆性器官损害的重要因素［17］。因此，监测疾病活动性在治疗LN的整个过程中都具有重要意义。另外，蛋白尿是预测患者肾预后的重要指标，持续大量蛋白尿是患者进展至ESRD的主要原因［18］。研究表明，在第12个月时实现蛋白尿小于0.8 g·d-1是LN患者肾长期预后良好的预测因素［19］。所以，临床上治疗LN的重要目的就是能够尽早实现蛋白尿完全缓解。本研究结果显示，LN患者血浆MCSF水平与uPCR呈正相关。此外，本研究结果表明高血浆MCSF水平患者基线肾功能较差，且MCSF水平与LN患者Scr呈正相关。而有研究表明，疾病确诊时合并肾功能降低是LN患者长期肾预后不良的独立危险因素［20］。以上则说明血浆MCSF水平升高还可能与LN患者病情严重程度及预后不良有一定的关系。本研究也存在一定的局限性：本研究纳入的样本量较小，可能对基线资料的比较具有一定的影响；本研究为横断面研究，MCSF水平与LN的发生及远期预后的因果关系的评估可能还需要之后长期随访观察以进一步验证；部分患者已经接受激素或免疫抑制剂治疗，药物性影响的可能性尚不能排除。

综上所述，通过检测健康人、LN及不伴肾损害的SLE患者的血浆MCSF水平，本研究发现LN患者血浆MCSF水平升高。高MCSF水平的LN患者发生浆膜炎的可能性更大，基线肾功能更差。此外，MCSF还与LN患者病情活动性、尿蛋白水平及肾功能相关。因此，MCSF或许可以作为一种评估LN的发生、监测病情活动及肾功能恶化的生物标志物。