硼对皖西白鹅产蛋期下丘脑中GRB2、HSP70和AMPK基因表达的影响

2022-05-18赵春芳杨同生赵香帅韩玉皎靳二辉胡倩倩李升和

皖西学院学报 2022年2期

赵春芳，陈宁，张路，杨同生，赵香帅，韩玉皎，任曼，靳二辉，2，胡倩倩，李升和

(1.安徽科技学院动物营养调控与健康安徽省重点实验室，安徽凤阳 233100；2.安徽安丰堂动物药业有限公司，安徽庐江 231521)

鹅是我国最早饲养的水禽之一，鹅喜水，合群性好，较耐寒，易于养殖，在整个中国分布广泛。鹅的品种也是十分丰富，根据《中国畜禽遗传资源志⋅家禽志》记载，我国有30个地方家鹅品种。鹅具有多种经济用途，可生产鹅肉、鹅蛋、鹅绒和鹅肝，但鹅的繁殖受制于季节，不能达到经济效益最大化。影响繁殖的主要因素是母鹅会表现出季节性就巢，就巢就是人们所说的“抱窝”，是禽类产蛋后特有的行为。母鹅就巢时会停止下蛋，同时会出现许多特殊的生理行为，比如采食减少，单独行动，毛色无光泽，护窝性明显增强，不同地区的鹅会表现出不同的就巢性。长时间的就巢会对鹅的生长发育以及下一个产蛋期带来负担[1]。

皖西白鹅是安徽省优良的地方品种，抗病力强、耐粗饲、耗料少，但是产蛋期短、就巢性强，低产性能严重影响其推广繁育。目前已有多位学者分析不同鹅品种、不同产蛋阶段下丘脑、垂体和卵巢中基因的表达差异，筛选出许多候选基因[2，3]。

硼是一种具有生物活性的微量元素，人体可以从水果、蔬菜、豆类、坚果和饮用水中获得这种元素，它还被广泛用于医疗保健、工业、农业和化妆品行业中[4-6]。硼显示出多种作用，在骨骼发育、中枢神经系统、细胞膜的完整性和功能、矿物质的代谢、免疫调节和内分泌调节中发挥各种作用[7-11]。

我们在饲料中添加不同浓度的硼酸，分析硼对皖西白鹅生长和繁殖性能相关基因表达的影响。有学者研究发现，禽类的就巢可能与一些环境因素和饲养环境因素有关，当鹅受到这些因素刺激时，就有可能导致就巢相关基因表达水平的改变从而出现就巢情况[1]。本试验基于前期研究成果，选取3个候选基因为检测对象，分别是生长因子受体结合蛋白2(GRB2)、热休克蛋白70(HSP70)和磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)，分析这三个基因在皖西白鹅产蛋期中不同硼添加水平下的差异表达。表达差异显著的基因将为下一步从分子水平研究鹅产蛋性能的潜在机制，为生产中鹅产蛋性状的选育提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取120只体重相近、健康的一年龄皖西白鹅，随机分为三组，其中对照组饲喂基础日粮，实验组在饲喂基础日粮的条件下，分别添加不同比例的硼元素。由于硼元素的添加量需要用于专利申请，具体的添加比例将在专利授权后公布。实验周期为60天。屠宰后采集皖西白鹅的下丘脑组织，用DEPC水处理后，储存于-80 ℃。

1.2 RNA的提取

取出保存在超低温冰箱的组织，暂时存放在放有液氮的容器中。用研钵将组织磨成粉末，其间保持研钵内有液氮，防止组织中的RNA降解。RNA的提取采用的是Invitrogen公司的Trizol试剂。然后用1.5%的凝胶电泳液检测RNA质量，质量完好的RNA保存于-80 ℃。

1.3 cDNA的制备与检测

cDNA的制备采用TransGen公司的EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒试剂，按照试剂的说明书操作，将之前制得的RNA解冻，依次加入试剂和RNA溶液，放入PCR仪器中按照反转录程序制备cDNA。以cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR检测在不同营养条件下，皖西白鹅产蛋期下丘脑中GRB2、HSP70和AMPK基因的表达变化情况，其中GRB2、HSP70、AMPK和GAPDH基因的引物序列如表1所示。

表1 用于荧光定量PCR的引物序列

1.4 统计分析

所有数据均以平均值±标准误表示。利用SPSS 21.0软件中One-way进行差异显著性检验，采用Duncan进行多重比较分析。当P<0.05时表示数据之间差异显著；当P<0.01时表示数据之间差异极显著。

2 结果与分析

2.1 RNA提取的质量

经纯度、浓度检测，RNA的质量符合标准。在下丘脑样品中，A260/A280为1.9～2.0。在1.5%凝胶电泳检测中，RNA带形较为清晰，完整性较好，表明RNA没有被降解，并且加样孔中没有亮带，这个则表明RNA没有被污染。RNA条带清晰，证明RNA没有被降解。

图1 提取的总RNA电泳图

2.2 荧光定量结果

2.2.1 GRB2基因在下丘脑中的表达水平

如图2所示，与对照组相比，在基础日粮中添加不同浓度的硼都会使GRB2基因的表达量极显著下降(P<0.01)。GRB2基因为生长因子受体结合蛋白2(Ash)，它是由中间结构域SH2和两侧作为连接臂的SH3结构域所构成，其中SH2可以与部分受体蛋白磷酸化区域相结合[12]。GRB2作为一种衔接蛋白，广泛分布于下丘脑-垂体-卵巢轴，有促进细胞增殖、分化以及卵泡发育的功能，能够参与多种信号通路的传导[13]。据相关研究表明，该基因是ERK信号通路上的重要基因，而该通路与鹅产蛋性能有较大的相关性。孙永峰等通过荧光定量PCR技术对籽鹅的不同等级卵泡进行了分析，结果表明GRB2的相对表达量在不同卵泡中存在明显的差异[14]。固始鸡饲养中利用饮水补硼，结果显示100mg/L硼添加量能够使鸡的体重和体增重发生显著增加，具有促进生长发育的作用[15]。而本实验发现硼抑制该基因的表达，关于硼调控该基因表达的参考文献较少，具体的作用机制需要进一步探索分析。

图2 下丘脑GRB2基因表达水平

2.2.2 HSP70基因在下丘脑中的表达水平

如图3所示，与对照组相比，在基础日粮中添加不同浓度的硼都会使HSP70基因的表达量极显著下降(P<0.01)。热休克蛋白的表达与应激作用有关，热休克蛋白分泌量减少，提示鹅对环境的应激减少。HSP70是一类非常保守的蛋白质，对于动物的应激有很强的保护性，能够保护细胞免受应激原刺激，提高细胞的抵抗力，在蛋白质折叠、运输和组装的平衡等生理过程中起着至关重要的作用。HSP70在热应激时被大量的合成和消耗[16]。所有的动物都通过合成HSPs在细胞水平上对热应激做出反应，这有助于保护细胞免受热诱导的伤害[17]。HSP70可能提高猪的热耐力。屠云洁(2010)等发现，在寒冷反应中HSP70是鹅下丘脑的一个上调转录本[18]。饲养鸵鸟过程中在饮水中添加低浓度的硼酸，发现HSP70蛋白表达量发生上调[19]。本实验中添加微量元素硼可以使HSP70的表达量下降，而皖西白鹅产蛋期大多在冬季，推测硼或许可以增强个体的抗应激能力。

图3 下丘脑HSP70基因表达水平

2.2.3 AMPK基因在下丘脑中的表达水平

如图4所示，与对照组相比，在基础日粮中添加不同浓度的硼都会使AMPK基因的表达量极显著下降(P<0.01)。AMPK和机体的葡萄糖平衡有关，它的低表达会使鹅的代谢降低。AMPK是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在分子水平上属于异源三聚体蛋白质。该激酶由α、β和γ三种亚单位组成，催化亚基α存在两种同源异构体，β存在两种调节亚基，γ存在三种调节亚基，在β亚基C末端存在的保守结构域是形成AMPK三聚体的关键，可以形成12种不同的复合物[20]。动物机体各个组织内广泛存在着AMPK的亚单位，表明AMPK有能够参与许多机体代谢反应的可能。比如骨骼肌中葡萄糖和脂肪代谢就有AMPK的参与，肝脏中AMPK能够抑制糖异生等[21，22]。下丘脑是调节食欲和能量平衡的关键中枢，而AMPK在其中起着重要的作用[23]。最近的一些研究表明，AMPK在下丘脑水平的食欲控制中起着关键作用[24]。AMPK不仅可以通过介导下丘脑中厌食和饥饿信号的拮抗作用来调节能量摄入和体重[23]；还可以调节下丘脑中转录本的表达以及脂肪酸、胆固醇和葡萄糖代谢中关键代谢酶的表达活动[25]。有实验表明禁食可以增加下丘脑区域的AMPK活性，刺激摄食，而抑制下丘脑AMPK活性则会导致食欲减退和体重减轻[22，23]。对产蛋前期和产蛋期四川白鹅下丘脑的转录组进行分析，发现AMPK在产蛋期表达上调，这可能是产蛋鹅食物摄入量增加的基础[26]。有趣的是，本试验中发现添加硼会使AMPK的表达量出现下调，而试验组和对照组中鹅的采食量并未发生明显变化(未发表)，硼元素通过何种机制调节AMPK基因表达还需要进一步研究。