自噬受体蛋白p62的表达及功能研究①

王 娇 张 莉 李 颖 王 慧 王 湛 刘宏图

（中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，国家卫生健康委员会医学病毒和病毒病重点实验室，北京 102206）

p62（sequestosome-1，SQSTM1）是一种重要的自噬衔接蛋白，越来越多证据表明p62 在氧化应激反应中发挥重要作用，并充当泛素化底物的自噬受体。p62 蛋白含有多个功能性结构域，包括泛素相关（UBA）结构域、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白作用区（KIR）、微管相关蛋白1A/1B 轻链3作用域（LIR）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）结合结构域、Phox 和Bem1p（PB1）结构域和ZZ 型锌指区（ZZ）等6 个功能区域［1-3］。p62 蛋白异常表达与神经退行性病变（如亨廷顿病、阿尔茨海默病、帕金森病）、肿瘤、感染性疾病、遗传性疾病以及慢性疾病发生发展密切相关［4-5］。

p62 蛋白可结合多种配体，并作为多种信号传导级联的信号传导中枢，如Keap1-Nrf2、m-TOR 和NF-κB信号通路［6］。其中，Keap1-Nrf2通路是抗氧化和亲电应激的主要细胞防御机制之一［7-8］。正常情况下，Keap1 同源二聚体通过双位点结合识别Nrf2单体，Nrf2 被泛素-蛋白酶体降解［9］。暴露于氧化应激或亲电损伤后，Keap1 被氧化剂修饰，导致构象变化。Nrf2 从Keap1 相互作用中逃逸并转移至细胞核以诱导一系列编码抗氧化剂和抗炎酶的Nrf2 靶基因［10］。 磷 酸 化 的 p62 通 过 Keap1 相 互 作 用区 域（Keap1 interaction region，KIR）结构域与Nrf2竞争性结合 Keap1，使 Nrf2 从 Keap1 上解离，累积于细胞中［11］。 另 外 ，JENA 等［12-13］研 究 显 示 ，p62 可 与TRIM16、Nrf2 形成复合物，对错误折叠蛋白转化为蛋白聚集体起重要作用，有利于肿瘤生长。因此，本研究试图通过免疫共沉淀和质谱法探究p62 和Nrf2 的相互作用，寻找p62 作为自噬相关蛋白在Keap1-Nrf2通路与自噬间的新功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株和细胞 大肠杆菌DH5α 感受态细胞购自宝日医生物技术（北京）有限公司；真核表达质粒载体nFLAG/pRK5 和HEK293T 细胞由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肿瘤相关病毒室保存。

1.1.2 试剂与仪器 限制性内切酶BglⅡ、SalⅠ和DNA 分子量标准购自 NEB 公司；Ex Taq 酶、dNTPs Mix 和10×PCR Buffer 购自宝日医生物技术（北京）有限公司；T4 DNA 连接酶、DNA 片段纯化试剂盒、DNA 凝胶电泳回收试剂盒和DNA 连接试剂盒购自德国QIAGEN 公司；反转录试剂盒SuperScript Ⅲ试剂盒购自Invitrogen 公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；氨苄青霉素（Amp）购自Invitrogen 公司；酵母提取物、蛋白胨、琼脂粉和琼脂糖购自AMERESCO 公司；DMEM 培养基购自美国Hyclone 公司；p62 抗体（5114S）购自美国 CST 公司；Nrf2抗体（ab62352）、山羊抗鼠二抗（ab6789）和山羊抗兔二抗（ab205718）购自美国Abcam 公司；小鼠抗FLAG-tag 单克隆抗体（F1804）和β-actin（A2228）购自美国Sigma公司；银染试剂购自美国Bio-Rad公司；引物合成由上海生工（生物）工程有限公司完成，质粒测序和蛋白质谱检测由北京华大基因完成；Western blot 成像采用 ChemiScope 6200 Touch 化学发光成像分析系统（上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成 根据GenBank 中SQSTM1 基因序列（Variant 2，NM_001142298），采用Primer Premier 6.0软件设计引物，SQSTM1正向引物序列：5'-TCGAAGATCTATGGCGTCGCTCACCG-3'（下划线部分为BglⅡ酶切位点），SQSTM1反向引物：5'-GATCGTCGACATTCAACGGCGGGGGATGCT-3'（下划线部分为SalⅠ酶切位点），扩增片段大小为1 100 bp。引物由上海生工（生物）工程有限公司合成。

1.2.2SQSTM1（p62）基因PCR扩增 按照QIAGEN RNeasy Mini kit 说明书从HeLa 细胞中提取总RNA，Invitrogen SuperScript Ⅲ反转录试剂盒得到cDNA，PCR 扩增目的基因，反应体系为：模板 cDNA 1 µl，正反向引物（2 µmol/L）各 2.5 µl，Ex Taq 0.25 µl，dNTP Mix（2.5 mmol/L）4 µl，10×PCR buffer 5 µl，加ddH2O 补至 50 µl。反应条件：95 ℃ 5 min→95 ℃1 min，55 ℃ 90 s，72 ℃ 3 min，5 个循环→95 ℃ 20 s，55 ℃ 90 s，72 ℃ 3 min，30个循环→72 ℃ 10 min。

1.2.3 自噬相关蛋白p62 真核表达载体构建与鉴定 真核表达质粒载体nFLAG/pRK5 图谱见图1。双酶切空载体nFLAG/pRK5 和SQSTM1基因，采用T4 连接酶将SQSTM1基因连接至 nFLAG/pRK5 真核表达载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，质粒提取试剂盒提取重组质粒nFLAG-SQSTM1/pRK5，BamHⅠ单酶切后通过琼脂糖凝胶电泳和测序对重组质粒进行进一步鉴定。

图1 质粒载体nFLAG/pRK5图谱及酶切位点Fig.1 Plasmid vector map of nFLAG/pRK5 and restriction sites

1.2.4 目的基因表达 转染前将HEK293T细胞接种至6 孔板，融合率达到60%~80%时进行转染。待转细胞孔中分别转染nFLAG-SQSTM1/pRK5（FLAG-p62）质粒和 nFLAG/pRK5 空载体质粒 1 µg，转染试剂为X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent，转染比为1∶3，转染48 h后提取总蛋白。

1.2.5 表达产物Western blot 鉴定 BCA 法进行蛋白定量。采用4%~20%SDS-PAGE 胶，取25µg样品进行电泳，转至0.45 µm NC 膜，室温封闭1 h，PBST漂洗3 次，5 min/次，以 p62 抗体为一抗（1∶1 000 稀释）4 ℃孵育过夜，PBST 洗涤3次，10 min/次，以山羊抗鼠为二抗（1∶20 000 稀释）孵育 1 h，PBST 洗涤3次，10 min/次，ECL显色，发光，分析结果。

1.2.6 重组p62 蛋白功能鉴定 实验分为4 组：不转染质粒组、仅转染FLAG-p62 质粒组、仅转染HA-Nrf2 质粒组、共转染 FLAG-p62 和 HA-Nrf2 质粒组。将待转质粒5.0µg 加入至1 ml opti-MEM，滴加转染试剂 15 µl，室温放置 15~20 min。转染 48 h 后采用非变性裂解液充分裂解，取上清，加入40µl 充分重悬的抗FLAG-M2 亲和凝胶（ANTI-FLAG M2 affinity gel）或抗HA 亲和凝胶（EZviewTMRed Anti-HA Affinity Gel）4 ℃ 缓 慢 摇 动 2 h，8 000 r/min 离 心1 min，弃上清，PBS 洗涤5 次后去除上清，加入40 µl RIPA 裂解液和 10 µl 5×SDS-PAGE 电泳上样缓冲液，100 ℃沸水浴5 min；取20 µl样品用于SDS-PAGE电泳，转膜，用Nrf2 特异性抗体（1∶2 000）、p62 特异性抗体（1∶1 000）分别进行检测。

1.2.7 质谱鉴定Nrf2免疫复合物 转染前将HeLa细胞接种至100 mm 培养皿，融合率达到60%~80%时进行转染。将待转FLAG-Nrf2质粒5.0µg加入至1 ml opti-MEM，滴加转染试剂 15 µl，室温放置15~20 min。转染48 h 后采用非变性裂解液充分裂解，取上清，加入40µl充分重悬的抗FLAG-M2亲和凝胶（ANTI-FLAG M2 affinity gel）4 ℃缓慢摇动2 h，8 000 r/min 离心 1 min，弃上清，PBS 洗涤 5 次后去除上清，加入40 µl RIPA 裂解液和10 µl 5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，100 ℃沸水浴5 min；取20 µl 样品用于SDS-PAGE 电泳，银染后切胶条，进行蛋白质谱鉴定。

2 结果

2.1SQSTM1基因扩增及真核表达载体构建 以HeLa细胞cDNA为模板，设计引物扩增SQSTM1基因。电泳结果显示，约1 100 bp 处出现扩增条带（图2），与预测目的片段大小一致。重组真核表达质粒nFLAG-SQSTM1/pRK5 经BamHⅠ单酶切后的DNA电泳结果见图3，质粒测序结果经BLAST 对比与GenBank检索获取的SQSTM1基因序列完全一致。

图2 PCR扩增SQSTM1基因Fig.2 Amplification of SQSTM1 gene by PCR

图3 nFLAG-SQSTM1/pRK5质粒经BamH Ⅰ单酶切电泳图Fig.3 Electrophoretogram of plasmid nFLAG-SQSTM1/pRK5 single restriction digested by BamH Ⅰ

2.2 p62 蛋白表达 Western blot 结果显示，转染FLAG-p62 质粒组采用p62 蛋白特异性抗体检测后出现明显特异性条带，未转染质粒组和转染nFLAG/pRK5 空载体质粒组未出现相应条带，表明p62 目的蛋白表达成功（图4）。

图4 Western blot检测p62蛋白表达Fig.4 Expression of p62 protein detected by Western blot

2.3 p62 蛋白与Nrf2 蛋白相互作用 Western blot结果显示，抗FLAG-M2 亲和凝胶免疫共沉淀后，采用 Nrf2 抗体检测，HA-Nrf2 和 FLAG-p62 质粒共转染组（泳道4）在110 kD 处可检测到条带，蛋白大小与Nrf2蛋白一致；而未转染质粒的对照组、转染HA-Nrf2质粒组和转染FLAG-p62 质粒组未检测到Nrf2 蛋白相应条带（泳道1、2、3）。同样在抗-HA 亲和凝胶免疫共沉淀后，HA-Nrf2 和FLAG-p62 质粒共转染组（泳道4）在62 kD 处检测到条带，蛋白大小与p62 蛋白一致；而未转染质粒的对照组、转染HA-Nrf2质粒组和转染FLAG-p62 质粒组未检测到p62 蛋白相应条带（泳道1、2、3）。Input 组Western blot 结果显示，转染 HA-Nrf2 质粒组、HA-Nrf2 和 FLAG-p62 质粒共转组均可在110 kD 处检测到Nrf2 蛋白特异性条带；转染 FLAG-p62 质粒组、HA-Nrf2 质粒和 p62 质粒共转染组均可在62 kD 处检测到p62 蛋白特异性条带（图5）。表明Nrf2 蛋白与p62 蛋白在细胞内存在相互作用。

图5 免疫共沉淀检测Nrf2-p62蛋白相互作用Fig.5 Interaction of Nrf2-p62 proteins by immunoprecipitation

采用抗FLAG-M2 亲和凝胶分离FLAG 标签融合蛋白，即捕获Nrf2 蛋白免疫复合物样品进行银染，银染结果见图6A。Western blot结果显示免疫共沉淀得到Nrf2 免疫复合物（图6B）。Nrf2 免疫复合物经质谱检测共鉴定到666 个蛋白，2 920 个肽段，其中鉴定到内源性p62 蛋白，证实Nrf2 与p62 存在相互作用（表1）。

图6 SDS-PAGE和Western blot验证Nrf2免疫沉淀物Fig.6 Verification of immunoprecipitate of Nrf2 by SDSPAGE and Western blot

表1 p62-Nrf2蛋白复合物质谱鉴定Tab.1 Identification of p62-Nrf2 protein complex by mass spectrometry

3 讨论

细胞自噬可清除错误折叠蛋白和导致线粒体损伤的物质，从而协助细胞存活［14］。p62 是一种自噬相关接头蛋白，作为受体参与清除泛素化蛋白过程。p62 蛋白对肿瘤发生具有双重调节作用。当自噬功能正常时，p62 对肿瘤起抑制作用［15］；但在肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和胰腺癌等恶性肿瘤细胞中p62表达远高于正常细胞［16-17］。

Keap1-Nrf2信号通路是最重要的氧化应激防御机制之一［8，18］，SQSTM1作为转录因子 Nrf2 启动的靶基因，可通过Keap1-Nrf2-ARE 通路产生正反馈环［4，19-21］。近年研究发现，过量 ROS 可引起 p62 蛋白Ser403 和Ser351 位磷酸化，磷酸化的p62 通过KIR区域结合Keap1 使Nrf2 解离并活化，而持续的Nrf2激活可导致肿瘤发生［11，22］。人 EBV 阳性 B 淋巴瘤细胞中，EBV 感染产生的活性氧诱导p62 累积并激活Keap1-Nrf2 信号通路，过量的p62 增强了细胞选择性自噬，并促进蛋白酶体对DNA 修复蛋白CHK1 和RAD51的降解，诱导肿瘤形成［23］。

因此，研究p62 与Nrf2 蛋白的关系对阐明肿瘤形成与进展具有重要意义。本研究构建了p62表达载体，在HEK293T 细胞中成功表达p62 蛋白，为p62蛋白功能研究奠定了基础。在此基础上通过免疫共沉淀和质谱验证了p62蛋白与Nrf2蛋白的相互作用。但本研究的局限性在于无法通过免疫沉淀物判断p62与Nrf2形成的复合物是否存在其他生物分子，且p62-Nrf2 蛋白复合物的生物学功能以及p62蛋白与Nrf2蛋白的结合位点尚未阐明。

综上所述，本研究认为p62 蛋白在Keap1-Nrf2通路中不仅可通过自噬降解Keap1从而促进Nrf2蛋白累积和入核，还可与Nrf2 蛋白形成复合物。但目前p62-Nrf2 蛋白复合体功能以及p62 蛋白与Nrf2 蛋白结合位点尚不清楚。课题组将进一步确定p62蛋白与Nrf2 蛋白的连接方式、相互作用位点以及p62-Nrf2复合物的生物学功能。