2015—2020年张家川县牛羊布鲁氏菌病流行病学调查与分析

李红梅

(甘肃省天水市张家川县动物疫病预防控制中心，甘肃 张家川 741500)

布鲁氏菌病(brucellosis)，可简称“布病”，是由布鲁氏菌属(Brucella)的细菌侵入机体，引起的人兽共患的传染变态反应性疾病，临床上以长期发热、多汗、乏力、关节疼痛，肝脾及淋巴结肿大为特点[1]，主要传播途径有：经皮肤粘膜直接接触感染，如兽医、屠宰、饲养人员直接接触病畜或病畜污染的水源、土壤、工具等。经消化道感染：食用未经高温杀菌的病畜肉类，或被污染的水或其他食物，经口腔、食道粘膜进入体内；或经呼吸道感染：在饲养放牧、皮毛加工等过程中接触到被布鲁氏菌污染的飞沫、尘埃等。布鲁氏菌病虽然病死率不高，但会严重危害人民身体健康，导致因病致贫，同时会严重影响畜牧业的发展，更会带来食品安全隐患。张家川县畜牧业主要以发展牛羊养殖为主，活畜调运频率高，动物疫病传染风险较大，张家川县被确定为布病防控三类地区，县人民政府召开了专题会议，成立了布鲁氏菌病防控工作领导小组，制定了《布鲁氏菌病防控工作方案》，对全县羊群全面开展布鲁氏菌病排查和流行病学调查，检测出阳性羊群，按照规定进行全群扑杀和无害化处理，同时对养殖圈舍等污染场地进行消毒，并落实扑杀补偿机制。为了解张家川县15个乡镇的布鲁氏菌病的流行情况，研究通过虎红平板凝集试验、试管凝集试验、PCR检测法对2015—2020年采集的牛、羊血清样品进行布鲁氏菌病流行病学调查，旨在了解张家川县布鲁氏菌病流行情况，对近几年布病防控成绩进行科学评判，也为张家川县牛羊布鲁氏菌病的防控工作提供科学参考[2]。

1 材 料

1.1 血清样品

2015—2020年随机采集全县1 245个场次的80 917份血清样品，其中羊血清样品70 992份，牛血清样品9 925份。

1.2 检测试剂

布虎红平板凝集试验抗原、标准阳性血清、标准阴性血清。血液基因组DNA提取试剂盒。

2 方 法

2.1 虎红平板凝集试验

2.1.1 器材及试剂 器材:清洁玻片、0.1 mL吸管、混合棒。试剂：虎红平板凝集试验抗原、标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清。

2.1.2 加 样 按照《动物布鲁菌病诊断技术》进行操作判定。首先用真空管采集待检牛羊样本并进行编号，待血清析出后，在玻璃板上标记待检血清号，在玻片上加25 μL待检血清，然后再滴加虎红平板抗25 μL，充分混匀，在5 min内观察结果，每批次实验设立阴性、阳性对照。为了确定诊断结果的准确性，采用试管凝集试验对呈假阳性的样品进行诊断，确保最终获得诊断结果的准确性。

2.1.3 结果判定 玻片上出现肉眼可见的凝集现象就判为阳性，液体均匀浑浊则判为阴性。

2.2 试管凝集试验

2.2.1 器材及试剂 器材:1 mL、10 mL加样器、玻璃试管、试管架、稀释抗原用的洁净容器、37 ℃培养箱。试剂：试管凝集抗原、被检血清、生理盐水。

2.2.2 配备稀释液 用0.5%碳酸和10% NaCl配备检测羊布鲁氏菌病的稀释液；用0.5%碳酸和0.9% NaCl配备检测牛布鲁氏菌病的稀释液。

2.2.3 加 样 第1管中首先加入920 μL稀释液，再加入80 μL被检血清；第2管中加入500 μL稀释液，再加入500 μL第1管混合液；第3管中加入500 μL稀释液，再加入500 μL第2管混合液；第4管中加入500 μL稀释液，再加入500 μL第3管混合液；每管中再加入500 μL(1∶20)的试管凝集试验抗原。将试管充分振荡后，全部放于37 ℃培养箱中孵育，20 h后取出，在室温放置1 h后观察结果。

2.2.4 结果判定 为了判定准确，制备凝集反应标准比浊管作为判定透明程度的依据，其配制方法如下：取凝集反应稀释的抗原液再作对倍稀释，即5 mL稀释抗原再加5 mL生理盐水，混合后按表1方法配制。

表1 试管凝集反应标准比浊管配制

血清对照为清亮透明无沉淀抗原对照为均勾混浊。在两种对照管都成立的情况下，才可判定试验管，否则应重做。“++++”液体完全透明，管底有伞状凝集，有时会有卷边，为100%凝集；“+++”液体近于完全透明，管底有伞状凝集，为75%凝集；“++”液体略微透明，菌体呈较薄伞状凝集，为50%凝集；“+”液体不透明，管底有不很明显的凝集，为25%凝集；“-”液体不透明，无凝集现象。效价以产生50%凝集的(++凝集程度)血清最终稀释倍数为受检血清的效价。大型畜血清试验的标准是凝集效价为1∶100++及以上为阳性；小型畜(羊)凝集效价为1∶50++及以上为阳性。张家川县2015年至2020年实验室牛、羊布鲁氏菌病阳性检出率分别为0.1%，1.89%。2015—2020年，张家川县牛布鲁氏菌病检出率分别为0，0，0，0，0.08%，0.14%；羊布鲁氏菌病检出率分别为2.84%，2.63%，1.82%，1.64%，1.56%，1.32%；规模养殖场羊布鲁氏菌病检出率分别为8.62%，6.12%，4.96%，4.68%，4.24%，3.23%。检测结果如表2、表3所示。

表2 2015—2020年羊、牛布鲁氏菌病血清学检测情况统计

表3 2015—2020年规模养羊场布鲁氏菌病血清学检测情况统计

3.2 PCR检测法

3.2.1 器材及试剂 器材：无菌0.2 mL PCR管、10 μL、20 μL、200 μL的移液器及吸头、PCR仪、电泳仪试剂：2*Taq PCR Master Mix、三蒸水、引物、琼脂糖凝胶、待检核酸、引物。

3.2.2 处理材料 使用200 μL血液，不足200 μL血液加入可加入缓冲液GA补足。共处理样品7份，其中羊血清4份，牛血清3份，阳性对照1份，阴性对照1份。

3.2.3 实验方法 提取DNA：样品处理结束后，加入20 μL Proteinase溶液，混匀；再加入200 μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70 ℃放置10 min，溶液变亮，简短离心去除管盖内壁的水珠；加入200 μL无水乙醇，充分振荡混匀15 s，简短离心去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状物都加入一个吸附柱CB3中，24 000 r/min 离心，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD，24 000 r/min 离心，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW，24 000 r/min 离心，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中，并且重复操作1遍；将吸附柱CB3放回收集管中，6 000 r/min 离心，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，去除材料中多余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置5 min，6 000 r/min离心，将溶液收集到离心管中。

PCR扩增：引物序列见表4(根据BCSP31核酸序列设计的1对B1、B2引物对布鲁氏菌进行核酸检测)。

反应体系见表5。扩增参数：预变性93 ℃，5 min，变性93 ℃，1 min；退火60 ℃，1 min；延伸72 ℃，1 min，40个循环。最后延伸72 ℃，10 min。凝胶电泳：PCR产物在1.5%琼脂糖上电泳，在凝胶成像系统中观察结果。

表4 BCSP31聚合酶链式反应引物序列、产物长度

表5 聚合酶链式反应体系

结果(图1)判定：阳性对照出现特异性条带，阴性对照未出现条带时实验成立。样本出现扩增目的片段长度为224 bp时，判为核酸检测阳性。第一孔为Marker，第二孔为阳性对照，第三孔为阴性对照，1～4号样品为羊血清，5～7号为牛血清，经结果判定：1号、4号羊血清、5号、6号、7号牛血清全部为阳性。

图1 凝胶电泳成像图

3 讨 论

从检测结果可以得出，张家川县持续存在羊布鲁氏菌病的发生，主要发生在规模养殖场，自2015年至2020年规模养羊场阳性检出率递减，检出感染牲畜主要是外地调入牲畜，说明在牲畜引进的过程中检疫监督工作漏洞很大。因为体制改革的原因，动物检疫部门的官方兽医被合并到农业农村局的执法大队，动物检疫工作力度不够，导致染疫牲畜流入。此外，牛群布鲁氏菌病的检出率较低，2019年的检出率为0.08%，2020年的检出率为0.14%。但是2020年比2019年有所增长，因为2019年、2020年精准扶贫工作的推进，国家对我县畜牧养殖业进行大力扶持，许多养殖户从外地大量购入牛，落地检疫工作跟不上，导致大量布病牛引入，加之养殖户对布病造成的危害、防治布病的知识了解甚少，致使购入或饲养患有布病的牛羊，成为布病的传染源，为张家川县的布病防控工作带来难度。其次，张家川县的养殖户对母畜流产现象没有科学的防范意识，接羔及畜产品加工时很少采取有效的防护措施，自我防护的意识淡薄，饲养时没有做到生产区与生活区严格分离，致使患畜传染给同群畜和人，这也是人感染布病的重要因素。第三，畜及畜产品的流通(特别是跨省、跨市、跨县、跨乡的流通)缺乏检疫，由于活畜交易及畜产品的流通频繁，经营者有意逃避检疫，贩运户通过各种途径、从外地低价收购牛羊，也是布鲁氏菌病传播的重要途径。

4 防 控

(1)政府应该制定有效控制布病的管理办法，对饲养、屠宰、加工、经营、仓储、运输等生产环节进行严格监督管理，严格执行牲畜检疫，加强输入牲畜的检疫和管理，防止外地染疫牲畜及其产品流入，购进的健康易感动物必须出具布鲁氏菌病检测合格报告。牲畜调入后严格执行落地报告和隔离观察制度，隔离饲养30 d后县经动物卫生监督所检疫合格后，方可混群入圈，正常饲养。落实动物检疫申报、巡查、驻场等制度，实行"一对一"监管责任制，限制高风险地区易感动物向低风险地区流动，严禁疫区动物向非疫区流动。

(2)对供奶场户检测布鲁氏菌病合格后，发放《动物防疫合格证》后允许其经营。对可疑病例应及时采样，进行布鲁氏菌病血清学检测，血清学检测阳性者应开展病原学检测。调查发病畜群分布情况及畜群来源，养殖屠宰及交易场所情况，确定疫情发生可能的传染源传播方式以及疫情波及的范围，追溯致病畜群的来源，对受威胁区的畜群实施隔离，对阳性布病牛羊及时淘汰扑杀，同时对扑杀的布病阳性牛羊的农户进行补偿。

(3)畜牧养殖、皮毛贩运从业人员在助产和处理流产胎儿、死胎时，应该做好个人防护，穿戴工作服、戴乳胶手套严格消毒，严禁赤手处理流产物。不随意丢弃家畜的流产胎儿、胎盘等，对流产物及其物品要进行深埋、焚烧等无害化处理。被流产胎儿及其羊水污染的场地，用10%的漂白粉乳浸透垫草和地面，反复消毒2～3次。皮毛加工人员，工作前也要做好个人防护工作，对于来自布鲁氏菌病疫区的皮毛要在收购地点进行消毒处理，包装。养殖人员要养成良好的生活习惯，做到人畜分居，科学饲养各类家畜。定期开展畜牧养殖等高危人群的健康体检，真正做到早发现、早治疗，减少人感染布病的几率，保障人民身体健康[4]。

(4)定期开展流行病学调查和血清学抽样检测工作，加大布鲁氏菌病监测的覆盖面，对布病流行趋势进行评估，为布病防控工作制定科学防治方案[5]。

(5)尽早落实从事畜牧兽医人员的卫生津贴待遇，调动机关单位、养殖企业、个人及社会力量的参与，形成群防群控的良好局面。