优化顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用方法测定蜂蜜挥发性成分的研究

蔡秋萍，陆大鹏

（湛江市食品药品检验所，广东湛江 524000）

蜂蜜含有特殊的天然芳香气味，现大多数研究均围绕蜂蜜的非挥发性成分，如理化性质、生物活性成分等，蜂蜜的重要挥发性成分的鉴定却鲜少报道。蜂蜜的整体品质是多种性质成分组合的结果，因而有必要对蜂蜜的挥发性成分进行鉴定。

已知报道中，蜂蜜中挥发性成分主要包括烃类、醇类、醛类、酯类、酮类、醚类、苯及其衍生物、呋喃、吡喃和萜烯类等多类物质，这些挥发性物质的含量很低，且对高温敏感，且之前学者的前处理方法所选参数较多，实验设计较复杂，使用试剂较多，为简化实验，探索更加简易方便，省时快速的前处理方法，探究合理有效的提取方法提取蜂蜜的挥发性成分很重要[1-7]。本文对顶空固相微萃取法主要条件进行优化，尽可能全面地提取蜂蜜的挥发性成分，并能真实地反映其组成，为后续的研究分析奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

蜂蜜：荔枝蜜，来自广东佛山顺德。

1.1.2 仪器与设备

恒温水浴振荡器，SHZ-A，上海跃进医疗器械有限公司；电子天平，Qumintix 224-1CN，赛多利斯科学有限公司；手动固相微萃取装置，美国Supelco公司；萃取纤维头：50/30μm DVB/CAR/PDMS（二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷）、65 μm PDMS/DVB（聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯）、75 μm CAR/PDMS（碳分子筛/聚二甲基硅氧烷）、100 μm PDMS（聚二甲基硅氧烷），美国Supelco公司；凝胶色谱-气质联用仪，GDC/GCMS-QP2010，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理

蜂蜜从冷藏冰箱取出后放至室温，摇匀至样品呈均匀液体状态，备用。

1.2.2 挥发性成分提取方法

称取6 g蜂蜜样品，置于20 mL顶空瓶中密封，顶空瓶置于55 ℃恒温水浴锅中，将装有65 μm PDMS/DVB萃取头的手动固相微萃取装置插入顶空瓶中（萃取头使用前需进行老化），萃取头不触碰样品，55 ℃顶空吸附50 min，250 ℃解吸，进行气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）分析。

1.2.3 单因素实验条件优化

对1.2.2的挥发性成分提取方法进行单因素实验条件优化，对萃取头、萃取温度、萃取时间、称样量进行研究，确定顶空固相微萃取法的前处理参数。

（1）萃取头的选择。4个备选萃取头：50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS。准确称量蜂蜜样品于顶空瓶中密封，分别用4种萃取头在水浴中萃取后，进行GC-MS分析。

（2）萃取温度。称量蜂蜜样品于顶空瓶中密封，设置萃取温度为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃，分别在上述温度下萃取，进行GC-MS分析。

（3）萃取时间。称量蜂蜜样品于顶空瓶中密封，设置萃取时间为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min和70 min，分别按上述时间进行萃取，进行GC-MS分析。

（4）萃取样品量。设置称量量为1 g、2 g、4 g、6 g、8 g和12 g，称取上述重量的蜂蜜样品于顶空瓶中密封，在50 ℃萃取50 min，进行GC-MS分析。

1.2.4 分析条件

（1）萃取头的老化。固相微萃取头在使用前需在气相色谱的进样口进行老化，温度为250 ℃，时间为1 h。

（2）气相色谱条件。DB-5MS毛细管色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；初始温度40 ℃，保持 1 min，3 ℃/min升到100℃，保持10 min，再以 5 ℃/min升到150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。进样口温度250 ℃；载气He，流速1.5 mL/min；不分流进样。

（3）质谱条件。电离方式：电子轰击EI；离子源温度：200 ℃；接口温度：250 ℃；扫描模式：全扫描；扫描质子范围：35～500m/z；EI电子能量： 70 eV。各组分经过NIST17.0标准普库检索匹配。

2 结果与分析

实验结果以总峰面积和数量作为指标参数，获得较佳的顶空固相微萃取条件参数。

2.1 萃取头的选择

萃取头是一根涂有不同色谱固定相或吸附剂的熔融石英纤维，萃取头是固相微萃取技术的核心，直接影响着固相微萃取的效果。由表1可以看出，尽管4种萃取头都适用于挥发性成分的萃取，但是各自有不同专攻的应用范围，在分析香气成分以及挥发性物质上有着各自的优势。因此本实验考察这4种萃取头在蜂蜜中的应用，选取合适的萃取头。经GC-MS分析，结果如图1所示。

表1 4种萃取头的型号和推荐应用描述

在相同的萃取条件下，不同萃取头的萃取效果如图1（a），萃取蜂蜜中的挥发性成分总峰面积最大的萃取头规格是65 μm PDMS/DVB，萃取总峰面积最小的是50/30 μm DVB/CAR/PDMS规格的萃取头，理论上萃取头吸附材料的填充厚度与吸附容量为正相关关系，但实验结果表明，吸附材料的膜填充量大并不代表萃取的物质的量就多，原因在于蜂蜜的挥发性成分复杂，而萃取头的固定相具有选择性。

图1 4种萃取头萃取对总峰面积和峰数量的影响图

结合表1的萃取头推荐应用描述，可知蜂蜜的挥发性物质中气体分子和小分子量化合物的比例较小，MW 30～275型萃取头不足以涵盖蜂蜜挥发性成分的范围，更多的物质的量应该在MW 275以上。

仅从总峰面积来评价萃取头的吸附效果不够全面，总峰面积能表明萃取头吸附是否充分，可能情况是对蜂蜜中的挥发性单一成分或者其中的几种成分有较充分的吸收，但不能体现吸附的挥发性成分的种类是否齐全，所以需要评价峰数量指标。从图 1（b）中可以看出，萃取蜂蜜挥发性成分峰数量较多的萃取头规格是65 μm PDMS/DVB，峰数量达到84个，其次是50/30 μm DVB/CAR/PDMS，峰数量达到60个，而75 μm CAR/PDMS和100 μm PDMS吸附的峰数量相对较少，仅为32个和41个。峰数量越多表明吸附的挥发性成分种类越多，吸附的挥发性成分数量与萃取头的固定相有关。实验结果表明，萃取头含有DVB这种固定相材料更有利于提取蜂蜜中的挥发性成分。

结合总峰面积和峰数量综合评价萃取头，4种萃取头规格中适合蜂蜜中挥发性成分分析的为65 μm PDMS/DVB。

2.2 萃取温度的优化

在本方法中，蜂蜜没经过复杂的预处理，或是溶剂萃取，因此温度对萃取效率的影响尤为重要。选择合适的温度是确保最佳萃取速度和灵敏度的关键。实验结果如图2所示。

图2 萃取温度对总峰面积和峰数量的影响图

从图2（a）的结果显示，蜂蜜在同等的萃取条件下，随着温度的升高，萃取物质的总峰面积整体呈现递增趋势，这与随着温度的上升有关，分析物热运动加强，挥发性成分在顶空空间中分配系数变大，而且可能产生新的物质，所以总峰面积总体是递增的趋势。而图2（b）中萃取温度对峰数量的影响是正向的，在50 ℃时峰数量达94个，50～70 ℃的峰数量基本一致。综合评价总峰面积和峰数量，需要找到一个合适的温度既能真实充分体现蜂蜜挥发性物质的种类，有足够的物质的量进行分析，又尽量不产生新的物质，在50～60 ℃选择，本实验考虑使用60 ℃为较好的萃取温度。

2.3 萃取时间的优化

顶空固相微萃取的萃取过程是一个动力学平衡的过程，选择合适的时间十分重要。实验结果如图3所示。

图3 萃取时间对总峰面积和峰数量的影响图

图3 中是萃取时间对蜂蜜萃取的影响，可以看到随着时间的延长，蜂蜜萃取的总峰面积和峰数量都呈现着递增的趋势，且在40～70 min，总峰面积和峰数量趋于相同，在60 min达到总峰面积最高和峰数量最多。基于在顶空微萃取优化实验已得到较佳萃取头、萃取温度的前提下设计了萃取时间的实验，为得到较好的萃取效果，在确保萃取效果的情况下，应选择较短的分析时间，本实验所选择的萃取时间为60 min。

2.4 萃取样品量的优化

在顶空固相微萃取中，顶空空间体积直接影响着顶空吸附的效率，顶空空间体积与样品取样量及顶空装置的比例有关。本次实验结果如图4所示。

图4 称样量对总峰面积和峰数量的影响图

从图4可以看出，随着取样量的递增，总峰面积和峰数量的变化规律是一致的，均呈现先上升再下降的趋势。在较少取样量时（1 g、2 g、4 g），总峰面积和峰数量变化不明显且均在较低水平，样品量为6 g和8 g时，总峰面积和峰数量均达到较高水平，之后随着取样量递增（10 g、12 g），萃取效果显著变差。因此，取样量8 g时样品的顶空空间体积与样品量的比例较合适，本实验选择8 g为蜂蜜的取样量。

3 结论

对顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法的前处理条件进行优化，实验结果以总峰面积和峰数量为指标进行比较，得到顶空固相微萃取的最佳参数为蜂蜜称样量为8 g，使用65 μm PDMS/DVB的萃取头，在60 ℃下萃取60 min，且本实验设计简单、快速、环保，能真实有效地反映蜂蜜中的挥发性成分的含量情况。本研究为蜂蜜挥发性成分的研究提供一定的理论依据。