中药肾毒性的研究进展

庄延双,蔡宝昌,张自力,孟庆香

(1.南京中医药大学泰州附属医院,江苏 泰州 225300;2.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023)

中医药是我国医学智慧的结晶,在中华民族生息繁衍中发挥着至关重要的作用,也逐渐走向国际舞台,特别是新冠肺炎暴发以来,以中西医结合的治疗策略取得了巨大的成效。但值得注意的是，在中医药发挥治疗作用的同时,其毒性作用也不容忽视。20世纪60年代,中药马兜铃酸肾毒性作用的发现,使中药肾毒性逐渐引起人们的重视。肾脏具有血流量丰富、耗氧量大、组织代谢率高、酶作用活跃等特点,是人体代谢和排泄的重要器官,药物在滤过、重吸收和排泄过程中可能引起肾损伤,特别是在肾功能不全时,其损伤作用更为明显。在临床应用中,常见的肾损伤包含了急性肾损伤和慢性肾损伤,有些中药的不当使用可引起肾小管和肾小球功能损伤,严重的可导致肾组织结构发生改变。众所周知,一方面由于中药具有多成分、多作用靶点的特点,且中药在临床应用中常以中药复方的形式治疗疾病,这无疑增加了学者们研究中药肾毒性的难度;另一方面由于人们对于中药认识的不足,大剂量、常规剂量长期服用及中药伪品的使用,使得中药引起肾损伤的几率大大增加。因此，正确地了解中药肾毒性的现状,并在中医药理论的基础上,提出中药肾毒性研究的策略和方法,是学者们不容忽视的重要问题。本文总结了国内外中药肾毒性研究现状,为具有肾毒性中药的临床合理应用提供一定参考。

1 肾毒性产生原因及作用机制

1.1 肾毒性产生的原因

肾脏主要是通过肾小球的过滤作用而使药物代谢物排出体外,维持机体的稳定状态[1],这就导致人体在服用中药时,如果药物不及时排出体外,很容易导致肾损伤。产生肾毒性的原因有很多,主要有以下几个方面。

1.1.1 药物本身具有肾毒性活性成分 具有肾毒性活性成分的中药种类有很多,根据化学成分的不同,将这些有肾脏毒性的化学成分进行分类,可分为含生物碱类如乌头(乌头碱、次乌头碱、新乌头碱等)[2]、马钱子(马钱子碱、士的宁)[3]、益母草(益母草总生物碱)[4]等,含黄酮类如半枝莲(总黄酮)[5]等,含蒽醌类如大黄(大黄素、芦荟大黄素等)[6]等,含苷类成分如栀子(栀子苷)[7]、商陆(商陆皂苷乙和商陆皂苷丙)[8]等,含萜类与内酯类如甘遂、大戟、雷公藤(雷公藤甲素)等,含毒蛋白类如蓖麻子、苍耳子、巴豆、相思子、蜈蚣等,含金属离子成分如朱砂(HgS)、轻粉(Hg2Cl2)、铅丹(Pb304)、汞(Hg)等,含有机酸类如关木通、广防己、夹竹桃、细辛等。根据《中国药典》、部颁标准以及地方药材标准中记载进行统计，马兜铃科中药材有24种、含马兜铃属中药材的中成药口服制剂有47种[9],其他有毒成分还有斑蝥(斑蝥素)、蛇床子(蛇床子素)、川楝子(川楝子素)等。这些含有肾毒性成分的中药在临床不合理应用会引起不良反应。

1.1.2 炮制、煎煮和配伍不当导致肾毒性 中药需要经过炮制成中药饮片后方能入药,经过炮制可以起到减毒增效、纠正偏性和去除非药用部位等目的,如朱砂、轻粉等矿物药,需要经过水处理除去游离的汞后方可使用,否则会引起肾损伤;有些具有肾毒性的中药经炮制后,在实际服用过程中常需要适当煎煮进一步降低毒性,如乌头需要久煎;但有些中药如山豆根应避免久煎以产生肾毒性。研究表明,中药和西药联合使用需要合理配伍,否则可能产生不良反应,如注射用双黄连与葡萄糖联用可产生不溶性微粒,在代谢中造成肾损伤[10]。

1.1.3 对中药认识不足导致肾毒性 由于中药品种和基原较多,常存在同名异物、同物异名的现象,若认识不足，会造成含有不同药理成分的中药混淆使用,使得一些具有肾脏毒性成分的中药代替了没有肾脏毒性成分的中药应用于临床中,导致中药不良反应的发生,如粉防己和广防己同属于防己科,但广防己中的马兜铃成分可产生肾毒性,在临床应用中应使用无肾毒性成分的粉防己;关木通和川木通同属于木通科,正是由于将含有马兜铃酸类成分的关木通误使用于龙胆泻肝丸中,导致了中草药肾毒性事件的发生,有研究表明使用川木通可明显降低龙胆泻肝丸的不良反应[11]。

1.1.4 大剂量或长期服用中药产生肾毒性 部分患者在使用中药时,由于自身认识不足,盲目大剂量或长期服用一些本身并没有毒性的中药或者本就有肾毒性但需要严格控制剂量的中药,导致安全事件的发生;或者由于患者年龄、性别、个人体质和机体状态等方面的差异导致中药肾毒性。具有肝肾毒性的苍耳子在《中国药典》中的规定剂量为3～6 g，有报道中记录有家长使用数10 g苍耳子，煎煮后治疗儿童鼻炎，导致儿童中毒[12]。

1.2 中药产生肾毒性的机制

马兜铃酸作为产生肾毒性的热点成分,在国内外已经有了很多研究,其产生毒性作用的机制主要有内质网应激反应、氧化应激、马兜铃酸-DNA加合物、细胞毒假说、缺血缺氧假说、免疫反应假说、上皮细胞转分化为肌成纤维细胞、肾小管上皮细胞坏死或凋亡、马兜铃酸生物转化等;其中，雷公藤甲素、姜黄素可通过氧化应激引起细胞凋亡;含草酸盐中药可诱导肾细胞凋亡机制;其他类中药可能直接损害肾小管、肾小球、肾间充质,中药致溶血反应导致肾功能损害、肾炎性改变、抑制肾有机阴离子转运体Oat1、Oat2、Oat3的功能[13-30]。一些常见中药产生毒性原因、作用机制和毒性表现见表1。

表1 一些常见中药产生毒性原因、作用机制和毒性表现Table 1 Causes, mechanisms and manifestations of toxicity of some common traditional Chinese medicines

(续表)

2 肾毒性的常用评价方法

2.1 动物模型

常见评价肾毒性的动物包括了大鼠、小鼠、家兔等。中药肾毒性的研究包括了急性肾毒性研究、产生肾毒性的最小剂量研究、肾毒性作用机制研究和肾毒性物质基础研究等。急性肾毒性研究常采取的方法为给予小鼠/大鼠低、中、高3种不同剂量的中药/复方/中药或复方的提取物/中成药后,观察14 d内小鼠/大鼠血清中尿酸、尿素氮、肌酐的含量,肾脏的肾小球滤过率、血流量、排泄比、酚红排泄试验、尿酶、尿蛋白的含量,观察肾脏的病理切片是否出现肾小球萎缩、细胞排列疏松、色素沉积、细胞坏死、炎症细胞浸润、肾小管空泡化等。其他研究常采用给予大鼠一定剂量的中药/复方/中药或复方的提取物/中成药的方式开展试验,常使用的评价指标包括血清肌酐、尿素氮、尿酸含量,肾脏中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和总抗氧化能力(T-AOC),以及病理学观察。

上述传统的动物模型存在实验成本昂贵、周期长、指标灵敏度低、存在物种差异等缺点,斑马鱼的出现在一定程度上克服了上述问题。斑马鱼具有发育快、体积小、周期短、胚胎透明易于观察等特点,同时斑马鱼的基因与人类基因有87%的高相似度,信号传导通路、生理结构和功能与人类具有较高相似性[31],故使用斑马鱼进行肾毒性的筛选较为接近人类的肾毒性表现[32]。谌晶晶等[33]研究发现马兜铃酸在6.8 μg·mL-1的浓度下处理24 h,斑马鱼均死亡,明确了马兜铃酸具有肾毒性。王雪等[34]采用分子定量方法检测斑马鱼幼鱼组织中肾损伤因子KIM-1蛋白含量和基因表达水平,研究发现马兜铃酸可引起斑马鱼幼鱼KIM-1蛋白含量和基因表达水平增加,说明马兜铃具有一定的肾毒性。

2.2 体外细胞模型

体外细胞毒性实验具有周期短、成本低等特点,可实现定量自动化高通量检测与筛选,大大提高了中药毒性检测的效率。常用的细胞模型为人肾小管上皮细胞系(HK-2和HKC),犬肾小管上皮细胞(MDCK)等。HK-2细胞功能接近原代培养的肾小管细胞,是药物肾毒性及肾小管损伤机制研究的重要细胞模型。MDCK细胞是一种犬肾小管细胞,其特点是具有细胞汇合后表达分化的上皮细胞特性,拥有典型的选择性阳离子上皮细胞旁通道和大量能反映早期肾损伤的肾小管刷状缘酶[35]。郝然等[36]以测试了不同浓度的马兜铃酸对MDCK细胞单层的透过率的影响,发现马兜铃酸可引起MDCK细胞膜完整性的破坏,且呈一定的毒性-剂量关系,因此建立在微孔滤膜上的MDCK细胞单层可作为药物肾毒性早期检测的方法。陈松杰[37]以马兜铃和苦参分别为阳性对照和阴性对照,通过MTT法测定细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态及乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞膜损伤,研究广防己对MDCK细胞的体外肾毒性,研究发现广防己和马兜铃可引起MDCK细胞膜的损伤,与苦参组相比具有统计学差异。

2.3 荧光探针技术

荧光探针是指在紫外-可见-近红外区有特征荧光,并且其荧光性质(激发和发射波长、强度、寿命、偏振等)可随所处环境的性质,如极性、折射率、黏度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。用荧光探针进行活细胞成像目前已发展成为生物学研究最重要的技术之一,广泛应用于流式细胞术、免疫分析、分子生物学、细胞分析、细胞凋亡、细胞毒性检测及对肿瘤细胞的识别等多个领域的研究[31]。赵筱萍等[38]使用荧光探针技术识别了巴豆、草乌、牵牛子等32种有毒中药对HK-2细胞的毒性,发现巴豆等14味中药的31个组分对HK-2细胞有明显的细胞毒性,该方法快速筛选了有毒中药,提示在使用这些中药时需要制定相应毒性成分的质量标准,防止临床上不良反应的发生。

2.4 网络药理学技术

网络药理学技术是基于“疾病-基因-靶向-药物”相互作用网络,是一个通过观察药物干预和影响疾病,揭示复杂药物对人体的协同作用,寻找高效低毒的药物的有效方法[39]。网络药理学可通过一定的数据库和平台建立起中药化学成分-靶点-通路之间的复杂网络关系,可为揭示中药的药效作用机制和毒性作用机制提供一定的参考依据。郝俊霞等[40]通过网络药理学筛选出了雷公藤中30种潜在毒性成分,通过GO富集分析和KEGG通路分析,初步认为雷公藤可通过诱导凋亡而产生肾脏损伤。张敏新等[41]通过高分辨质谱鉴定分离出雷公藤多苷片中的雷公藤多苷类成分,通过数据库匹配发现这些潜在毒性化学成分可通过钙信号通路、PI3K-Akt信号通路、癌症通路等导致肾毒性。

2.5 代谢组学技术

代谢组学技术是系统生物学的重要组成部分,是继基因组学和蛋白组学,在20世纪90年代发展起来的一门新兴学科[42]。由于代谢组学技术应用大规模信息提取技术和多变量处理技术对动物整体的内源性代谢物进行分析,其研究模式与中药“多成分、多靶点”需整体研究的策略不谋而合,越来越多的研究人员将代谢组学技术应用于中药学的研究。赵剑宇[43]运用基于核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)的代谢组学技术发现关木通的肾毒性作用与能量代谢中糖酵解、三羧酸循环、能量代谢途径的改变有关,与线粒体的功能降低、氧化磷酸化和脂肪的氧化有关。刘金伟[44]基于NMR的代谢组学技术推测细辛可使得肾脏中琥珀酸浓度升高而引起肾脏炎症,可能引起肾脏组织能量代谢异常,从而影响脂质代谢导致肾细胞死亡。

2.6 毒理基因组学技术

传统的急性毒性实验和长期毒性实验,往往以病理切片为指标,但对毒性机制研究不太深入,毒理基因组学的兴起克服了这个缺点,它可以从基因的角度揭示药物毒性的机制,发现药物毒性的差异基因。研究中药基因组学的常用技术方法有基因芯片技术和DNA分子标记技术。目前基因芯片技术常用于中药药物靶点的预测、中药作用机制的研究、中药毒性的研究、中药有效成分的筛选、中药质量控制、中药材鉴定和道地药材鉴别等多个方面的研究。徐婷婷等[45]采用基因组学技术探讨了商陆肾毒性的作用机制,与对照组相比,商陆高剂量组和低剂量组分别有2 560和1 923个差异基因表达,通过KEGG通路分析这些差异基因主要涉及的功能通路包含了信号转导通路(MAPK、VEGF、Erb B和T细胞受体等信号通路)及细胞凋亡、蛋白消化吸收、嘌呤代谢等,最终发现商陆可能通过激活MAPK、JNK和p38的3条信号通路,直接或间接引起炎症反应、细胞凋亡等导致肾毒性。

3 降低中药肾毒性的策略

3.1 正确识别中药,防止误用

正确识别中药,涉及了多种中药从业人员,中药饮片种植人员和销售人员要增强法律意识,防止发生掺假的行为;同时要加强中药饮片采购人员辨别中药近似品种及伪品的能力,防止购入伪品;临床医师在使用中药饮片时需正确辨识古籍中的药材同时结合病人肝肾功能情况,防止认知和经验不足导致误用有肾毒性的中药饮片。

3.2 合理炮制,降低毒性

中药炮制是中医用药的传统特色,中药材需经过炮制成中药饮片后,才可用于调剂和制剂使用,其传统意义就在于中药炮制可以减毒增效、纠正偏性和去除非药用部位等。对于具有肾毒性的矿物药,要严格按照炮制方法,去除游离的Hg2+;马钱子需要砂烫降低士的宁和马钱子碱的含量,减少不良反应的发生。

3.3 根据中药药性,使用合理的剂量

《儒门事亲》中论及“凡药有毒也,非止大毒小毒谓之毒,甘草、苦参不可不谓之毒,久服必有偏胜”,说明在临床应用中需要严格控制无论是有毒还是无毒中药的剂量。对于有毒中药,切忌在刚开始治疗时就采用大剂量,宜从小剂量开始服用,而后逐渐加量,并定期检查患者的肾功能。

3.4 辨证论治,合理配伍

在临床应用中,除了运用单味中药治疗疾病以外,常常在辨证论治的基础上运用中药复方治疗疾病,所以在研究中药肾毒性过程中,不能孤立地看待中药的肾毒性,要结合中药与证候、中药与机体之间的关系辩证研究中药的肾毒性;在辨证论治的同时，需要关注患者的基础疾病，对于肝肾功能不全的患者应尽量避免使用具有肾毒性的药物，如不可避免使用，则需要加强药物对于患者肾功能影响的监测。

3.5 加大毒性中药量效研究

除了药材质量、道地性等因素外，中药的剂量与其效用、毒性关系密切，中药的剂量、各药味之间的比例变化，不仅可以改变药效，而且会改变其功能主治；有毒中药的使用尤为值得关注，临床医师在治疗疾病过程中应“以症为靶、以证为基、以病为参”，针对症、证、病选择药物的最佳用量，平衡量、效、毒之间的关系。

中医药是我国祖先智慧的结晶,是经过几千年传承下来的瑰宝。在临床应用中药过程中,切不可片面夸大中药的毒性,因噎废食,应结合中药的品种、炮制、剂量、煎煮和配伍情况,因人、因地、因时制宜,做到药证相符,辨证施治,才能更好地应用中药,减少不良反应。随着科技的发展,人们对于中药肾毒性认识的不断深入,相信未来会有更加快速、准确研究中药肾毒性的方法,指导具有肾毒性的中药在临床合理使用,避免不良事件的发生。