C型肉毒梭菌毒力提高的试验

次旦白玛，彭燕娟，索朗卓嘎，李鸿仁

西藏自治区兽医生物药品制造厂,西藏拉萨 850008

肉毒梭菌是指能够生产肉毒梭菌毒素，引起动物中毒的细菌总称，其中C型肉毒梭菌最为常见。肉毒梭菌，也称肉毒梭状芽孢杆菌，是一种革兰氏阳性芽孢梭菌，严格的厌气菌，两端钝圆，多单在或成对，无荚膜，易于在液体培养基和固体培养基上形成芽孢，芽孢卵圆形，位于菌体近端。适合生长温度为28～37 ℃，pH为6.8～7.6。肉毒毒素并非肉毒活的肉毒杆菌释放，而是先在肉毒杆菌细胞内生产无毒的前体毒素，在肉毒杆菌死亡自溶后才具有毒性。

肉毒中毒分布于世界各地，我国主要分布在新疆、西藏、甘肃等地区，发病主要以青壮年牛为主，病死率高，常规治疗无效。肉毒梭菌是一种土壤腐生性细菌，通常以芽孢形式广泛分布于自然界和动物肠道，在适当环境条件下，芽孢发芽形成繁殖体，生长繁殖并产生毒素。肉毒梭菌芽孢有很强的抵抗力，在180 ℃下干热5～15 min，100 ℃湿热5 h左右，或高压蒸汽121 ℃温度灭菌30 min才能杀死肉毒梭菌芽孢。我厂肉毒梭菌C型灭活疫苗免疫效果良好，对牛羊的C型肉毒梭菌中毒症得到了控制。我厂仍以常法生产，存在着产毒能力低、免疫注射计量大，给预防注射带来一定的困难，疫苗生产成本也较高，为此进行了此次试验[1]。

1 材料

1.1 菌种

肉毒梭菌C型菌株CVCC60353购自中国兽医药品监察所。

1.2 仪器

离心机型号：TGL-16LM-B；生物安全柜型号：BSC-1300ⅡA2；电热恒温培养箱型号：DHP-9272；冷藏冷冻箱型号规格：BCD-221WRB1NYC；显微镜 OLYMPUS CX41；电子天平型号：FA2004B。

1.3 培养基

肉肝胃酶消化汤半固体：西藏生药厂小培组提供；新鲜肝子：研发组取健康兔子肝；50%葡萄糖；自制培养基：西藏生药厂研发室制备。

1.4 试验动物

由西藏生药厂质检室动物组提供，SPF级，体重14～16 g健康小鼠，随机编组，不分雌雄。

2 试验方法

2.1 分组

为了更能说服改进后肉毒梭菌C型毒力提高，我们做了三次重复试验，即分为第一组、第二组、第三组。按照培养基和培养方法不同分为一号瓶、二号瓶。

2.2 制备培养基

3瓶500 mL研发室自制培养基，标记为一号瓶，进行120 ℃灭菌30 min冷却后放常温备用。3瓶500 mL肉肝胃酶消化汤半固体西藏生药厂小培组提供，标记为二号培养基。西藏生药厂小培组提供培养基加入无菌新鲜兔肝块。

2.3 具体试验方法如下

2.3.1 第一组培养方法

第一组一号瓶接种肉毒梭菌C型1.5%菌液，同时加入已灭菌0.2%葡萄糖（50%），培养期间进行流加方式加入自制的培养基，普通温箱35 ℃培养7 d。二号瓶接种肉毒梭菌C型1.5%菌液，同时加入已灭菌0.2%葡萄糖（50%），普通温箱35 ℃静置培养96 h。

2.3.2 第二组培养方法

第二组一号瓶和二号瓶培养方法同2.3.1。

2.3.3 第三组培养方法

第三组一号瓶和二号瓶培养方法同2.3.1。

2.4 肉毒梭菌c型鉴定

1纯粹检验：取第一组一号瓶和二号瓶肉毒梭菌C型种子，分别在TG小管、厌气肉肝汤小管、GA小管培养基上接种，每种培养基接种2支，每支剂量为0.2 mL，其中1支在37 ℃环境下培养，另一只培养温度为25 ℃。观察3 d，检验结果为纯粹，符合兽药典的要求[2]。②培养特性：本菌为严格的厌氧菌，在肉肝胃酶消化汤半固体培养基中呈中等生长，在厌气肉肝汤中生长不良或不生长，培养基加入新鲜生肝块时，生长良好，产气，有臭味。取第一组一号瓶和二号瓶肉毒梭菌C株种子，在鲜血琼脂平板上厌气条件下，37 ℃培养48 h，菌落为不规则的圆形，直径3 mm左右，半透明，边缘不整齐，有略大于菌落的溶血圈。培养结果符合兽药典要求。

2.5 毒力试验

取样测定菌液上清毒素含量；用明胶磷酸盐缓冲液进行稀释，分别稀释如下表1～3，每个稀释度尾静脉注射3只14～16 g小鼠，0.2 mL/只，连续观察3 d并记录小鼠死亡情况。

表1 第一组

3 结果

3.1 三组结果

表2 第二组

表3 第三组

各组小鼠死亡结果看出，对培养和培养方法改进后收获的肉毒梭菌C型种子毒力远远高于改进前培养方法取得种子毒力。

3.2 镜检结果

肉毒梭菌属于厌气性梭状芽孢杆菌属，C型肉毒毒素在普通营养琼脂平板上常见略带黄色的中心，表面一般比较光滑，也有呈颗粒状的。在较湿润的平板上易生产成片状[3]。血平板上比较大的β溶血环。C型肉毒毒素的形态一般粗大杆菌，约为4×1 µm的大杆菌，一般单个存在，偶见成双或短链，两端平行，两端钝圆、直杆状或稍微弯曲，有4～8根周生鞭毛，运动迟缓，无荚膜，芽孢为卵圆型，位于次极端，使菌体呈钥匙形状或者网球拍形状，偶有位于中央，常见很多游离芽孢。革兰氏染色阳性。

4 讨论

4.1 简化操作方法

通过本次试验对肉毒梭菌C型培养基和培养方法改进后得到菌液测定毒力结果能看出，我们自制的培养基和培养方法是对的，对比常规培养法既提高了毒价，又简化了添加新鲜肝子繁琐程序。

4.2 降低成本

肉肝胃酶消化汤半固体培养基制备繁琐，成本高，而我厂研发室自制的培养基是干粉培养基，制备简单，成本低。该操作方法无需加入新鲜肝块，减少了种子用量，细菌生长及产毒具有较高的稳定性，细菌培养过程同时也是毒素的纯化过程，工序简单，有效解决了传统培养方法的缺陷。

4.3 为我厂实施新版《兽药质量管理规范》打下理论基础

2020年6月1日起，所有兽药生产企业要执行新版《兽药生产质量管理规范（2020年修订）》，目前西藏生药厂生产C型肉毒梭菌灭活疫苗，仍以常法生产，存在着不易生长、产毒能力低、抗原纯度差、免疫计量大等问题。这次通过改进培养基和培养方法不仅为我厂更好执行新版兽药要求，（对肉毒梭菌C型发酵罐进行缩小）打下理论基础，也更为西藏畜牧业稳定发展添砖加瓦。