柚皮素－β－环糊精包合物对镉致精子损伤的保护作用

胡振良　何奉姣　贺睿昕　黄耀　邓霖萱　袁衡

摘要：目的 探讨柚皮素对镉致大鼠精子损伤的干预作用及其可能的机制。方法 SPF级SD系成年雄性大鼠（200±20g）36只，动物适应1周后按质量随机分成6组：阴性对照组;模型组;Nar-β-CD干预组;阳性对照组。模型组和各干预组以及阳性对照组以0.4mg/kg体质量进行氯化镉腹腔注射染毒，阴性对照组注射等量生理盐水，连续进行4周。染毒的同时干预组分别灌胃50，100，200mg/kg Nar-β-CD，阳性对照组给予0.4mg/kg亚硒酸钠灌胃，阴性对照组与模型组灌胃等量生理盐水，持续4周并观察大鼠的一般情況，实验终末收集血清、睾丸和附睾等组织，待检测相关指标。结果 与模型组相比Nar-β-CD低、中、高剂量组干预后，血浆及睾丸组织镉含量显著下降（P<0.05），而睾丸组织中MDA均显著降低（P<0.05），中、高Nar-β-CD剂量组的超SOD和GSH-Px活性明显上升（P<0.05），血清性激素组中的T有所升高（P<0.05）;与模型组相比Nar-β-CD低、中、高剂量组干预后，精子密度均有所上升（P<0.05）精子畸形率均有所下降（P<0.05）。结论 柚皮素能够部分拮抗镉致大鼠精子损伤，可能与抗脂质过氧化和维持生精环境稳定以及抑制细胞凋亡有关。

关键词： 柚皮素;环糊精;镉;脂质过氧化;

镉（Cadmium，Cd）元素是一种常见的重金属污染物，镉元素主要是通过化肥、电镀、镍-镉电池生产等方式产生并在环境中残留[1]。Cd可能通过引起精子DNA氧化损伤而致精子损伤或畸形多个国家和地区已将Cd列为高危害有毒物质加以管理。美国环境保护署也将Cd纳入重要污染物名单，同时景观国际癌症研究所的长期研究，该元素长期接触还能致癌。将其列为Ⅰ级致癌物[2]。

柚皮素（naringenin，Nar）属于二氢黄酮类化合物，是一种单体，是柚皮苷的苷元，多是在一些柑橘类水果、西红柿、芸香科植物葡萄柚出现。国外学者经过对柚皮素的长期研究发现，它在抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗衰老都有特殊的疗效，在肝功保护、脂肪代谢免疫调节上有着良好的作用，在食品、医药领域被广泛应用与开发。

Nar具有抗氧化、抗衰老、免疫调节等作用，这些特性可能在Cd致精子损伤的治疗过程中起到积极作用，整理当前对Nar生物学性质的有限研究，暗示Nar能有效应用于Cd致精子损伤的治疗。假设Nar对Cd致精子损伤的治疗具有积极作用，本研究通过制作大鼠Cd致精子损伤的模型以观察Nar的药理作用，为Nar的开发及临床应用提供可靠的理论依据。

1.实验材料及方法

1.1主要药物与试剂

氯化镉Cdcl·5HO（分析纯）;β-环糊精β-cyclodextrin（分析纯）;柚皮素（纯度>98%）;二甲亚砜和亚硒酸钠;ELISA试剂盒，包括GSH-PX、血清性激素T、FSH、LH、 SOD、MDA。

1.1.1柚皮素-β-环糊精包合物（Nar-β-CD）的制取

要制取，先要称取Nar0.5克，将这0.5Nar溶解于少量乙醇中。按1：1摩尔比准确称取β-CD2.08g，称取少量蒸馏水，倒入β-CD2中，将其制成饱和溶液。然后将含有柚皮素的乙醇溶液加入其中，在60℃环境下进行30分钟的搅拌，将二者搅拌均匀，使其充分混合。在加热停止后继续进行5h的搅拌，继而将其冷却，放置在4℃环境下冷置一夜，第二天取出，过滤，将过滤出来的固体放置在保持40℃的真空干燥箱中进行24h的干燥。最后得出了76±3%产率的Nar-β-CD包合物。最终产率76±3%[3]。分装入密封玻璃瓶置于4℃冰箱保存，当需要用时放至室温后配制摇匀后进行灌胃。

1.2主要实验仪器

本次实验需要仪器包括医用离心机，上海一恒科学仪器有限公司的真空干燥箱，安捷伦火焰原子吸收光谱仪， Infinite F50酶标仪，显微镜，超净工作台，实验室用医学恒温水浴箱。

1.3动物分组及给药

在长沙天勤生物技术有限公司采购了36只许可证编号为SCXK（湘）2019-0014的成年雄性大鼠，都是SPF级SD系的，每只体质量（200±20g）;这36只大鼠每天维持普通饲料饲养。在检疫室观察一周后1周后按照体质量标号抽签随机分成6组：阴性对照组;模型组;50mg/kg Nar-β-CD干预组;100mg/kg Nar-β-CD干预组;200mg/kg Nar-β-CD干预组;阳性对照组。Nar-β-CD各剂量干预组、模型组这三组都采取体质量为0.4mg/kg的氯化镉腹腔注射染毒，注射期4周，阴性对照组则是给予生理盐水，同样也是给予0.4mg/kg体质量的生理盐水注射，连续4周都进行注射。除了对其进行染毒，还要同步进行干预，对低干预组给予50mg/kg的Nar-β-CD灌胃，中干预组则给予100，高干预组给予200，给予阳性对照组0.4mg/kg亚硒酸钠灌胃，阴性对照组与模型组灌胃等量生理盐水，持续4周并观察大鼠的一般情况。

1.4实验方法

1.4.1标本采集与组织处理

在实验进行第4周末，用10%水合氯醛进行腹腔麻醉，从眼底静脉丛采血，血液静置45min后进行离心制备血清，样品冷藏于-20℃冰箱中备用，同时解剖分离附睾、睾丸称取脏器湿重（模型组有一只右侧睾丸消失）。

1.4.2精子密度和精子形态的检查

迅速地取得各组大鼠一侧附睾尾，再次称重。置于附睾稀释液（预温36℃的台式液）2ml的小烧杯中，用眼科剪将其充分剪碎。将其吹打均匀，完成均匀吹打以后在35℃的温箱进行5-10分钟的孵育。放置一滴悬液在血细胞计数板上，在上面覆盖一张盖玻片，在进行2min的静置后，采取红细胞计数法（×400）进行精子数计算;清洁玻璃片的一侧放置一滴悬液，然后推片晾干再以甲醇固定5min，等干燥过后，使用20g/L伊红染色2h，冲洗干燥。在高倍镜下观察一千个较为完整的精子（考虑到畸形缺失部分），再记录畸形的精子数目，主要观察头体尾三部分的形态异常。

1.4.3睾丸组织的制备

根据实验需要，取一定质量睾丸，将睾丸组织的被膜去除，再将其称重，将睾丸实质剪碎，继而加入生理盐水，生理盐水比例为1∶4g/ml，再采用玻璃匀浆器制作睾丸匀浆液，将匀浆液放在低温高速离心机中，进行30min离心，离心转速为10000r/min，30min后将液体静置，提取上清液，放置在以便备用，主要是用来对睾丸组织内含有的SOD的酶活力、MDA含量、GSH-PX等的测量。

1.4.4血清性激素T、FSH、LH水平测定 按试剂盒用Elisa法测定

1.4.5睾丸组织与血浆的镉含量检测

睾丸和血清中的镉含量可以采用原子吸收光谱法石墨炉法进行检验。

1.5统计学处理

采用SPSS 23.0统计学软件统计分析各分组测量数据，采用平均数±标准差形式表示结果。各组数据采用SNK-q检验、单因素方差分析方式进行两两比较。

2.结果

2.1对大鼠血液、睾丸组织中Cd含量的影响

通过对阴性对照组和模型组大鼠血浆和睾丸组织中Cd含量的测算，得出：阴性对照组血液Cd含量为0.050±0.01 ug/L;睾丸组织含Cd量为5.23±0.89 ug/g。模型则的为1.355±0.08 ug/L，（P<0.05）;睾丸组织含Cd量为208.58±0.12 ug/g，（P<0.05），说明实验造模成功。分别对剩余各组血液、睾丸组织Cd含量的测算得出：与模型组相比，阳性对照组的血液Cd含量约为模型组的56%（P<0.05），差别具有统计学意义，而睾丸组织Cd含量约为模型组的72%（P<0.05），差别具有统计学意义。与模型组相比给予Nar-β-CD的浓度分别为50、100、200 mg/kg 时，血液Cd含量分别约为模型组的71%、49%、46%（P<0.05），差别具有统计学意义，而睾丸组织含Cd量分别约为模型组的89%、76%、67% （P<0.05），差别具有统计学意义。Nar-β-CD干预组随Nar-β-CD给予浓度越大，大鼠血液、睾丸组织内残留的Cd浓度就越小，既Nar-β-CD浓度越高其治疗效果越理想。最终获得实验数据具有统计学意义，表1是各组大鼠血浆镉和睾丸组织镉含量的比较数据情况。

Nar-β-CD：柚皮苷β环糊精包合物。对比阴性对照组， *P<0.05;与模型组相比较#P<0.05

2.2 对大鼠血清睾酮、黄体生成素卵泡刺激素的影响

在进行前面的测算可知，大鼠卵泡激素水平和黄体生成素并不受Cd的影响（P>0.05），即该数据差别无统计学意义。但在清睾酮水平方面，模型组的明显要比对照组的低很多（P<0.05），这也表明，大鼠清睾酮水平会受Cd影响，且影响较大。相较于阴性对照组Nar-β-CD干预组给予浓度为50mg/kg时血清睾酮水平约为阴性对照组的53%（P<0.05），差别具有统计学意义。但其血清睾酮水平，和模型组的相比并没有太大差别（P>0.05），差别不具有统计学意义，说明给予较低浓度的Nar-β-CD干预Cd致大鼠血清睾酮水平的能力有限。当给予Nar-β-CD浓度提高至100、200 mg/kg时，血清睾酮水平较模型组显著提高，分别提高约24%、36%（P<0.05），差别具有统计学意义。说明当Nar-β-CD达到一定浓度后，随给予Nar-β-CD浓度的提升，大鼠的血清睾酮浓度亦有所提升。具体数据如表2所示。

Nar-β-CD：柚皮苷β环糊精包合物。对比阴性对照组， *P<0.05;与模型组相比较#P<0.05

2.3对大鼠精子数目和精子畸形率的影响

通过对各组大鼠附睾尾部镜下精子的计数和观察得出：阴性对照组精子密度为37.34±1.45×106/100mg，精子畸形率约为2.5%。模型组精子密度跟阴性对照组相比，模型组的为10.37±0.75 ×106/100mg （P<0.05），但精子也有较高畸形率，这一数值高达17.8%、表明大鼠精子密度明显会受Cd影响，同时还会通过其影响导致精子畸形。各组精子密度明显比模型组高，精子畸形率低于模型组（P<0.05），差别具有统计学意义。其中Nar-β-CD干预组的治疗效果随给予Nar-β-CD的浓度的增加而不断增大，给予各个浓度干预下大鼠精子密度分别为13.04±1.59×106/100mg、24.24±2.24×106/100mg、27.97±0.68×106/100mg（P<0.05），差别具有统计学意义。精子畸形率分别约为13.6%、9.2%、6.2%（P<0.05），差别具有统计学意义。具体数据详见表3。

Nar-β-CD：柚皮苷β环糊精包合物。对比阴性对照组， *P<0.05;与模型组相比较#P<0.05

2.4对大鼠睾丸组织过氧化损伤的影响

模型组睾丸组织中的MDA较之阴性对照组更高，约为其1.8倍，模型组睾丸组织中的SOD、GSH-PX分别约为阴性对照组的79%、75%（P<0.05），差别具有统计学意义。说明Cd能通过减少大鼠睾丸组织内的SOD、GSH-PX的含量，从而增加了MDA的生成，致大鼠睾丸组织出现过氧化的损伤。相较于模型

组，明显阳性对照组的相关指标会更加优秀一些， MDA：7.10±1.04 nmol/ml，SOD：154.88±6.25 U/ml，GSH-PX：351.95±14.50 U/ml。Nar-β-CD干预组中，当给予Nar-β-CD較低时，其SOD、GSH-PX 的活力指标与模型组相差不大（P>0.05）。伴随Nar-β-CD干预组给予Nar-β-CD浓度的提升，MDA的浓度越低，SOD、GSH-PXD的活力指标越高。详见表4

Nar-β-CD：柚皮苷β环糊精包合物。对比阴性对照组， *P<0.05;与模型组相比较#P<0.05

3 讨论

柚皮素富含多种生物活性，它广泛的存在于西红柿、葡萄、柑橘类水果中，同时也是桃叶、枳实等中药的有效成分。很多学者都对柚皮素[4]进行了大量研究，景观研究也表明，它在抗纤维化、抗氧化、免疫调节、神经保护上都有着独特功效。Ortiz[5]等人检测柚皮素毒理性研究中，发现其属于OECD的第五等级，表明柚皮素毒性较小，安全性高。但它水溶性较差，缺乏良好的生物利用度，针对这一特点，可通过引入较强水溶性基因来修饰，采取这种方式能够提升柚皮素的生物利用度。环糊精分子[6]的外壁具有亲水性，同时还有富电性疏水空腔，一般常作用在稳定性差的药物分子载体或用来克服药物水溶性。XU[7]等人通过大量研究也表明，相对来说，柚皮素-β-环糊精包合物（Nar-β-CD）明显会有更高的生物活动和水溶性。

多位学者的长期研究表明，当体内进入镉以后，会导致体内细胞发生氧化损伤。出现DNA链断裂、脂质过氧化等。之所以会出现脂质过氧化是因为在镉的诱导下，大量活性氧（ROS）因此产生，过多的ROS会损伤体内细胞，导致细胞出现凋亡或突变的情况。谷胱甘肽（GSH）能够对这一现象进行缓解，它主要是受GSH-Px调控，一旦它的活性下降，就会减少GHS的生成。SOD，即超氧化物歧化酶能够将体内过量ROS清除，它是一种重要的抗氧化酶。脂质过氧化会产生丙二醛（MDA）[8]，所以脂质过氧化发生程度都可以用GSH-Px、SOD以及MDA的活性和含量的变化表达。明显本次研究中，睾丸组织在染镉后，MDA含量有明显的上升，而GSH-Px活性与SOD都有所下降，这也表明因细胞损坏增加了脂质过氧化产物，清除过氧化自由基因其变化有所下降。50、100及200mg/kg的Nar-β-CD干预组睾丸组织氧化产物MDA含量下降，抗氧化酶GSH-Px与SOD酶活力上升，提示Neg-β-CD对镉造成的脂质过氧化损伤有一定的保护作用。

本研究显示，染镉组的大鼠睾丸组织中的镉含量均非常明显上升，模型组相比阴性对照组镉含量高40倍，表明镉能通过血睾屏障进入睾丸，是镉的靶器官之一。睪丸功能可通过精子密度和畸形率来客观反映。通过研究发现，精子密度会受镉元素影响，低剂量镉能够导致精子畸形率上升7倍，密度下降72%，在组织受镉感染以后，会因为出现氧化应激，发生细胞损伤和调往。Ren[9]等人通过Bcl-2、Bax蛋白以及天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）水平变化推测出镉染毒引发睾丸生精细胞凋亡为内源性（线粒体）凋亡通路。此次研究表明，在降低精子畸形率、提高精子密度上， Nag-β-CD有一定的功效。睾酮参与精子发生的调控，LH可刺激睾丸间质细胞合成孕酮，并在3β-HSD的作用下转化成睾酮，本研究结果显示，血清睾酮下降近50%而FSH与LH均出现了一定程度下降，但是并没有统计学意义。血清性激素的水平变化提示下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）受到Cd环境的影响进而使得维系精子发生的微环境发生变化。

本实验研究通过制成Nar-β-CD包合物对低剂量镉污染雄性大鼠灌胃干预治疗，对各项相关指标进行检测，结果表明，Nar-β-CD中、高剂量组能够较为明显地抗脂质过氧化损伤，提高抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性，降低MDA的含量，使得机体减少受ROS的破坏，保护睾丸组织。同时降低血浆与睾丸组织内的含镉量，减少镉对机体的损伤，以及睾酮水平升高，维护HPG轴的稳定，使得精子发生的微环境趋于平稳，部分恢复生精功能。另一方面，Nar-β-CD可能降低生精细胞的凋亡，使得精子密度以及畸形率得以提高，但其作用机制尚有待研究。

参考文献：

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[2]Wang，Pan，Liu，Zhang，Zhang，Jiang，Xiao，Bai，Jiao，Huang. Dietary exposure to cadmium of Shenzhen adult residents from a total diet study[J]. Food Additives & Contaminants： Part A，2018，35（4）.

[3]郭亚宁.柚皮素-β-环糊精包合物的制备及表征[J].化学研究，2017，28（04）：457-461.

[4] 李燕，左玉梅，冯健.柚皮素改善糖尿病性心肌病的机制研究进展[J].国际药学研究杂志，2018，45（10）：743-747.

[5] Ortiz-Andrade R R，Sánchez-Salgado J C，Navarrete-Vázquez G，et al.Antidiabetic and toxicological evaluations of naringenin in normoglycaemic and NIDDM rat models and its implications on extra-pancreatic glucose regulation.[J]. Diabetes， obesity &amp; metabolism，2008，10（11）.

[6] Harata Kazuaki. Structural Aspects of Stereodifferentiation in the Solid State.[J]. Chemical reviews，1998，98（5）.

[7] 徐新荣，于海涛，杭丽，邵雁，丁淑华，杨学文.柚皮素β-环糊精包合物的制备及对模型大鼠脉络膜新生血管形成的抑制作用[J].中国药房，2014，25（11）：981-984.

[8]Nabin Yadav，Priya Rudingwa，Sandeep Mishra，Sakthirajan Pannerselvam. Ultrasound measurement of anterior neck soft tissue and tongue thickness to predict difficult laryngoscopy - An observational analytical study[J]. Indian Journal of Anaesthesia，2019，63（8）.

[9] 任香梅. 硒对镉致雄性小鼠生殖毒性的保护作用及其机理的研究[D].南京医科大学，2012.

基金项目：2019年度湖南省大学生创新创业训练计划项目：湘教通[2019]219号-2429;长沙医学院大学生创新创业训练计划项目：长医教〔2019〕61号–049;

第一作者：胡振良（1999.10-），男，本科在读，临床医学专业

*通讯作者：袁衡（1980.03-），女，硕士，副教授，研究方向：生殖