小建中汤对溃疡性结肠炎幼鼠结肠黏膜lncRNA ANRIL表达的影响

李洁 曲梅 黄婧怡 彭淑平

摘要：目的 建立幼鼠溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）模型，小建中汤行治疗干预，以长链非编码核糖核酸（long noncoding RNA，lncRNA）ANRIL（lncRNA-INK基因座反义链非编码，antisense noncoding RNA in the INK4 locus）为切入点，评估小建中汤对UC幼鼠的治疗作用。方法 60只Wistar幼鼠随机分为空白组，模型组，柳氮磺砒啶（SASP）组，中药高剂量组，中药中剂量组，中药低剂量组，除空白组外，其余各组予3%葡聚糖硫酸钠（Dextransulfate sodium salt，DSS），造模5天。空白组，模型组每日予蒸馏水灌胃，SASP组予SASP药液灌胃，中药高中低剂量组分别予小建中汤灌胃。用药7 d后，各组HE染色后评估结肠病理变化，实时荧光定量-聚合酶链式反应（real-time Quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测幼鼠结肠黏膜lncRNA ANRIL表达，酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测幼鼠结肠黏膜相关炎性因子白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）表达。结果 与空白组比较，模型组病理评分显著增高（P<0.05），与模型组比较，SASP组，中药各组病理评分下降（P<0.05）;与空白组比较，模型组lncRNA ANRIL表达显著增高（P<0.05），与模型组比较，SASP组，中药各组lncRNA ANRIL表达下降（P<0.05）;与空白组比较，模型组IL-1β表达显著增高（P<0.05），与模型组比较，SASP组，中药各组IL-1β表达下降（P<0.05）。结论 小建中汤可下调结肠黏膜lncRNA ANRIL的表达，抑制下游炎症因子IL-1β的分泌，达到治疗UC幼鼠的目的。

关键词：溃疡性结肠炎;小建中汤;长链非编码核糖核酸ANRIL;白细胞介素-1β

中图分类号：R516.1   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2022）05-0071-04

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种难治性炎症性肠病，病因未明，病變可累及整段结肠，以腹痛、腹泻、血便为主要临床表现[1-2]。近年研究表明，UC儿童患者逐年增加，发病较成人更为严重[3]。因此完善儿童UC的早期诊疗，是临床热点之一。目前内镜、肠黏膜病理活检是UC的有效诊断方法，但其创伤大，儿科应用受到限制[4]。Cuixia Qiao等[5]发现lncRNA ANRIL的上调可促进UC的发展，lncRNA ANRIL有望成为诊断儿童UC的新指标。UC难治愈，易复发，儿童可选药物少，中药复方小建中汤由桂枝三两，芍药六两，炙甘草二两，生姜三两，大枣十二枚，胶饴一升，6味中药组成，具有“温中健脾”的功效，与儿童“脾常不足”病机契合，且其味道甘甜，更能让儿童接受。有研究表明小建中汤可明显改善“脾胃虚寒”型UC患者的临床症状及体征[6-8]。本研究通过DSS冰水溶液诱导幼鼠“脾胃虚寒”型UC模型，根据幼鼠结肠黏膜lncRNA ANRIL及下游炎症因子IL-1β表达的变化，探讨小建中汤对儿童UC的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠雄性，3周龄（刚断乳），体质量40～50 g，动物合格证：44002100029803，由南方医科大学实验动物管理中心提供。

1.2 主要试剂 DSS（分子量为36000～50000），货号160110，由美国mpbio公司提供;RNAiso Plus，货号R0901，由美国sigma公司提供;SYBR Premix Ex TaqTM，货号PR036A，由宝生物工程（大连）有限公司提供;ELISA IL-1β试剂盒，货号ml037361，由上海酶联生物科技有限公司提供;SASP，批号09210409，由上海信谊天平药业有限公司提供;中药饮片由深圳宝安人民医院药房提供;

1.3 分组与造模 将60只Wistar大鼠随机分为空白组，模型组，柳氮磺砒啶组，中药高剂量组，中药中剂量组，中药低剂量组，每组10只。除空白组外，其余各组予0℃冰水灌胃，3%DSS冰水溶液代替饮用水，10℃凉水浴15 min/d，造模周期5 d。

1.4 给药 空白组与模型组每日予蒸馏水灌胃。柳氮磺吡啶成人每天用量为4～6 g，按成人等效剂量，柳氮磺吡啶组幼鼠每天用药量为0.45 g/kg。小建中汤由桂枝9 g，白芍18 g，生姜9 g，大枣12 g，炙甘草6 g，饴糖40 g组成，常规煎药，过滤，以成人等效剂量作为中剂量组，中药高、中、低剂量组幼鼠每天分别予生药量16.92 g/kg，8.46 g/kg，4.23 g/kg。

1.5 取样 麻醉处死大鼠，取整段结肠，清理内容物，生理盐水洗净，滤去多余水分。

1.6 病理组织结果

1.6.1 固定与包埋 截取中段结肠0.5 cm，4%多聚甲醛固定24 h;梯度乙醇脱水，70%乙醇1 h，85%乙醇1 h，95%乙醇1 h，100%乙醇50 min（重复2次）;二甲苯透明30 min（重复2次）;55℃石蜡封片（重复2次）;模具包埋。

1.6.2 切片 切取3 μm厚度，置于多聚赖氨酸附膜的载玻片上，65℃烘烤2 h。

1.6.3 染色 二甲苯脱蜡10 min（重复2次）;梯度乙醇置换二甲苯，100%乙醇5 min（重复2次），95%乙醇5 min，90%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，蒸馏水冲洗5 min（重复2次）;明矾苏木素浸染15 min，蒸馏水冲洗15 min;淡氨水返蓝1 min;1%伊红酒精液染色3 min;梯度乙醇脱水，95%乙醇30 sec，100%乙醇30 sec（重复2次）;二甲苯60 sec（重复3次）;中性树胶封片。

1.6.4 光镜下观察 镜下病理评分标准如下[9]：炎症程度，无炎症，0分;轻度炎症，1分;重度炎症，2分。病变深度：无病变，0分;病变侵及黏膜下层，1分;病变侵及肌层，2分;病变侵及浆膜层，3分。隐窝损伤：无损伤，0分;基底1/3隐窝被破坏，1分;基底2/3隐窝被破坏，3分;全部隐窝和上皮被破坏，4分。病理评分=炎症+病变深度+隐窝损伤。

1.7 结肠黏膜lncRNA ANRIL的表达

1.7.1 总RNA提取 取100 mg结肠黏膜样本，加入1mL RNAiso Plus，冰面研磨，离心后取上清液;加入200 μL氯仿，震荡，离心后取上清液;加入同体积异丙醇，静置，离心，取沉淀;加入1 mL 75%酒精，吹打，离心，取沉淀;待酒精挥发，加入50 μL去离子DEPC水，沉淀溶解后，-20℃保存。

1.7.2 引物合成 查阅文献，确定引物序列，以GAPDH为内参。见表1。

1.7.3 参照试剂盒说明操作，行逆转录及qPCR反应，采用2-△△Ct法，对结果分析。

1.8 结肠黏膜IL-1β的表达

1.8.1 结肠黏膜匀浆液提取 取100 mg结肠黏膜样本，加入1 mL 0.1M PBS，冰面研磨，离心后取上清液-20℃保存。

1.8.2 参照试剂盒说明操作，计算浓度，对结果分析。

1.9 统计学方法 实验数据采用SPSS软件分析，数据采用（x±s）表示，组间数据采用独立样本t检验和单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠病理组织切片观察 空白组结肠标本未见明显病理变化;模型组结肠标本见黏膜水肿，肠腺体破坏，大量炎细胞浸润;药物各组均见不同程度黏膜水肿，肠腺体破坏，炎细胞浸润。见图1。

2.2 结肠病理组织切片评分结果 与空白组比较，模型组结肠病理评分显著增高（P<0.05）;与模型组比较，柳氮磺砒啶组表达，中药各组表达均显著降低（P<0.05）。见表2。

2.3 结肠黏膜lncRNA ANRIL表达结果 与空白组比较，模型组lncRNA ANRIL表达结果显著增高（P<0.05）;与模型组比較，柳氮磺砒啶组表达，中药各组表达均显著降低（P<0.05）。见表3。

2.3 结肠黏膜IL-1β表达结果 与空白组比较，模型组IL-1β表达结果显著增高（P<0.05）;与模型组比较，柳氮磺砒啶组表达，中药各组表达均显著降低（P<0.05）。见表4。

3 讨论

UC是可累及全肠的难治性疾病，临床表现以腹痛、腹泻、黏液血便为主，属中医“泄泻”“肠风”范畴。儿童患者逐年增加，诊断困难，较成人表型更严重。lncRNA是序列长度大于200核苷酸的非编码RNA。越来越多证据表明，LncRNA在UC的发生发展中起关键作用[10、11]。ANRIL位于染色体9p21区[12]，近年研究普遍认为lncRNA ANRIL的上调可促进UC的发生发展，lncRNA ANRIL的表达有望成为UC诊断的指标。

IL-1β是白细胞介素IL-1的一种，参与多种生物学效应，上调免疫，促进下游细胞因子分泌，引起肠道炎症反应[13]，在UC的发生发展中起重要作用。

现已有大量的临床研究应用小建中汤治疗消化性溃疡[14]。儿童UC可选药物少，中医药治疗儿童UC疗效肯定，儿童脾常不足，喜食生冷，UC证型以“脾胃虚寒”居多，中药复方小建中汤是温中健脾的经典方，针对儿童“脾胃虚寒”型UC疗效确切。

DSS诱导的UC动物模型应用广泛，重复率高，病理学表现跟人类UC相似[15]。本研究通过物理刺激联合3%DSS冰水溶液代替饮用水，诱导“脾胃虚寒型”UC幼鼠模型[16]，模拟儿童“脾胃虚寒型”UC，予SASP，小建中汤行治疗干预，以结肠黏膜lncRNA ANRIL表达的改变为切入点。实验结果发现，模型组幼鼠可出现足温下降，扎堆，消瘦，血便，症状与“脾胃虚寒”病机契合，而用药各组均能不同程度改善上述症状。模型组结肠病理评分较正常组结肠病理评分显著增高，用药各组结肠病理评分较模型组结肠病理评分明显下降。模型组幼鼠结肠黏膜lncRNA ANRIL，IL-1β表达显著升高，提示lncRNA ANRIL参与UC的发生发展，机理可能与lncRNA ANRIL过度表达可促进IL-1β分泌相关。中药各组幼鼠结肠黏膜中lncRNA ANRIL，IL-1β的表达较模型组均有不同程度的下降，证明复方小建中汤可下调“脾胃虚寒”型UC幼鼠lncRNA ANRIL的表达，抑制IL-1β分泌，从而达到治疗UC的目的。

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（收稿日期：2021-11-12）