柴胡疏肝散对围绝经期综合征肝郁证大鼠行为学及血清T、PROG含量的影响

任秋萍 吴忧 沈建英 黄睿婷 梁文娜

摘要：目的 研究柴胡疏肝散對围绝经期综合征肝郁证模型大鼠行为学的影响及对血清中PROG（孕酮）、T（睾酮）含量的影响。方法 选取30只雌性SD大鼠，随机分成正常组、模型组和给药组，采用双侧卵巢去势手术加上经典的CUMS（慢性温和不可预知刺激）方法建立围绝经期综合征肝郁证的大鼠模型，用柴胡疏肝散在造模同时进行灌胃干预，共计21 d。造模前后2次进行行为学实验;实验结束后采用ELISA法（酶联免疫吸附法）测定各组大鼠血清中相应指标PROG（孕酮）、T（睾酮）的含量。结果 在旷场实验结果中，模型组的移动总距离和直立次数较正常组均下降（P<0.05），给药组的移动总距离比模型组显著增加（P<0.01），给药组直立次数比模型组增多（P<0.05）;在强迫游泳实验中，各组大鼠的游泳不动时间无差异（P>0.05）;ELISA实验结果中，模型组的睾酮、孕酮水平比正常组均下降（P<0.01）;给药组大鼠血清睾酮含量比模型组显著提高（P<0.01），给药组血清孕酮含量与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 柴胡疏肝散可改善围绝经期综合征肝郁证大鼠的抑郁样行为，提高大鼠血清中的睾酮激素水平。

关键词：围绝经期综合征;肝郁证;孕酮;睾酮;行为;柴胡疏肝散

中图分类号：R285.5   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2022）05-0062-04

Effects of Chaihu Shugan Powder on Behavior and Serum T and PROG Levels in Ratswith Perimenopausal Syndrome and Liver Stagnation Syndrome

REN Qiu-ping1，2， WU You1，2， SHEN Jian-ying1， HUANG Rui-ting1， LIANG Wen-na1，2

（1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China;2. Key Laboratory of TCM Health Status Identification of Fujian， Fuzhou 350122， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of Chaihu Shugan Powder on the behavior of rats with perimenopausal syndrome and liver stagnation syndrome and the effect on the level of PROG （progesterone） and T （testosterone） in serum. Methods： 30 female SD rats were selected and randomly divided into normal group， model group and administration group. Bilateral ovariectomy combined with classical CUMS （chronic mild and unpredictable stimulation） method was used to establish rat model with perimenopausal syndrome and liver stagnation syndrome. Chaihu Shugan Powder was used for gavage intervention at the same time as the model was established， for 21 days. Behavioral experiments were conducted twice before and after modeling. After the experiment， ELISA （enzyme-linked immunosorbent assay） was used to determine the contents of corresponding indexes PROG （progesterone） and T （testosterone） in the serum of rats in each group. Results： In the open field test results， the total moving distance and standing times of the model group were decreased than those of the normal group （P<0.05）. The total moving distance of the administration group was obviously increased than that of model group. The times of standing uprights of the administration group was more than that of the model group （P<0.05）. In the forced swimming test， there was no difference in the swimming immobility time of the rats in each group （P>0.05）. In the ELISA test results， the levels of testosterone and progesterone in the model group were decreased than those in the normal group （P<0.01）. Compared with that of the model group， the levels of serum testosterone in the administration group were significantly increased （P<0.01）. There was no statistically significant difference in serum progesterone levels between the administration group and the model group （P>0.05）. Conclusion： Chaihu Shugan Powder can improve the depression-like behavior of rats with perimenopausal syndrome and liver stagnation syndrome and increase the level of testosterone in serum of rats.

【Key words】Perimenopausal Syndrome; Liver Stagnation Syndrome; Progesterone; Testosterone; Behavior; Chaihu Shugan Powder

目前，我国已进入老龄化社会，围绝经期的人数也逐年增加。而围绝经期综合征是妇科常见病，主要包括失眠、月经改变、潮热、易激动、疲乏、头痛等，而该病的主要病因是性激素分泌紊乱以及植物神经功能紊乱[1-2]。围绝经期综合征发病率呈逐年升高趋势，并可引起骨质疏松、心血管疾病等一系列疾病。據世界卫生组织统计，2030年，将有12亿的妇女进入围绝经期[3-4]，且围绝经期综合征发病人群越来越年轻化，其发病率可高达91.2%[5]。妇女进入围绝经期发生的一系列变化与天癸竭、肝气衰、肾藏衰密切相关，肝失疏泄，则情志异常，临床以肝郁多见，而妇女围绝经期是“郁病”的高发年龄[6]。

临床研究表明，围绝经期妇女孕酮、睾酮水平较非围绝经期妇女降低[7-9]。本研究的目的是观测围绝经期综合征肝郁证大鼠的行为学表现以及验证柴胡疏肝散的解郁功效，并测定相关性激素指标的水平变化，为柴胡疏肝散的临床治疗提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 雌性SD大鼠30只，体质量为（230±20）g，于福建中医药大学动物实验动物研究中心进行喂养，大鼠来源于上海吉辉实验动物饲养有限公司（许可证：SCXK（沪）2007-0012）。

1.2 药物 其药物组成为柴胡、陈皮各6 g，白芍、枳壳、香附、川芎各4.5 g，炙甘草1.5 g（来源《景岳全书》），购买于实验室采购系统。

1.3 主要试剂 大鼠睾酮（T）/孕酮（PROG）ELISA 检测试剂盒（武汉华美生物科技公司，批号：CSB-E07282r）

1.4 主要仪器 Infinite M200 F200多功能酶标仪（美国无限公司）、 3K30冷冻高速离心机（美国赛格玛公司）;自制黑色木箱（长100 cm，宽100 cm，高40 cm）;圆柱形透明玻璃桶（底部直径20 cm，高45 cm）。

1.5 方法

1.5.1 分组 大鼠分3组，每组随机10只，分别为正常组、模型组和给药组。正常组大鼠只进行假手术;模型组进行双侧卵巢摘除手术与CUMS法;给药组在建立围绝经期综合征肝郁证模型的同时予以药物干预。

1.5.2 模型建立 正常组大鼠进行假手术，不摘除双侧卵巢，摘除卵巢旁部分脂肪组织。而模型组与给药组大鼠进行双侧卵巢去势手术，麻醉剂为10%水合氯醛，剂量为3 mL/kg，卵巢摘除后，肌内注射青霉素钠消炎（6万U/只）。术后休息1周后，除正常组外，其余大鼠接受21 d慢性温和不可预知应激处理。应激源包括禁水24 h、禁食24 h、4 ℃冰水刺激5 min、夹尾2 min、45°倾斜鼠笼24 h、束缚4 h、45 ℃热环境5 min，造模期间每天随机给予1种刺激，每种刺激1周不超过1次。

1.5.3 给药 正常组与模型组均以等量生理盐水灌胃;给药组在常规喂养同时采用柴胡疏肝散水煎剂灌胃，参照文献，大鼠的给药剂量为 3.31 g/kg，共灌胃21 d。

1.5.4 行为学实验

1.5.4.1 强迫游泳实验 将大鼠放进一圆柱形透明玻璃桶（玻璃桶高度50 cm）中并进行观察，记录大鼠4 min内的静止时间，实验前需对每组大鼠进行游泳适应性训练。

1.5.4.2 旷场实验 于造模前、造模后两次进行旷场实验;方法为将1只大鼠放入旷场箱最中央，记录大鼠的跑动轨迹以及垂直次数（以大鼠双前掌抬起离开地面记为一次垂直站立），记录时间为5 min，每只大鼠实验结束后，用酒精喷洒旷场箱并用毛巾清理干净，再进行下一只大鼠实验，重复之前的步骤。

1.5.5 血清孕酮、睾酮含量测定 ELISA法进行测定，使用相应的试剂盒并严格按照说明书步骤进行实验，以酶标仪测定出的吸光值计算相应指标在血清中的浓度。

1.5.6 统计学方法 符合正态分布的实验数据，采用单因素方差分析方法，结果以均值±标准差（x±s）表示;对于不符合正态分布的数据，采用非参数检验的方法，结果以中位数和四分位数（M（P25，P75））表示，运用统计学软件SPSS 25.0进行数据分析，得出相应结果;

2 结果

2.1 旷场实验结果比较 在造模前后分别进行旷场实验，记录每组大鼠总移动距离与垂直次数。结果显示，造模后，模型组的总移动距离与垂直次数比正常组均明显下降，差异有统计学意义（P<0.01）;给药组大鼠在总移动距离方面比模型组有上升趋势（P>0.05），给药组大鼠比模型组大鼠直立次数增多，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 强迫游泳实验结果 在模型建立前后两次进行强迫游泳实验，记录每组大鼠4 min内的静止不动时间。结果表明，造模后，模型组的游泳不动时间与正常组相比有上升趋势（P>0.05）;给药组大鼠不动时间较模型组有下降趋势（P>0.05）。见表2。

2.3 大鼠血清睾酮、孕酮含量比较 ELISA结果显示，实验后，模型组的大鼠血清中睾酮、孕酮含量较正常组显著下降，差异具有统计学意义（P<0.01）;给药组大鼠血清中的睾酮含量比模型组明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。给药组血清孕酮含量与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3 讨论

3.1 围绝经期综合征肝郁证模型的评价 文献研究表明，采用去势法建立围绝经期综合征大鼠模型已有较长的历史，摘除大鼠双侧卵巢后雌二醇等雌激素水平迅速降低，在组织形态学层面观察大鼠子宫会出现子宫内膜上皮萎缩的变化，且血管明显变细或数量减少[10]，与临床上围绝经期综合征妇女卵巢衰退的特征趋同，且手术简便，成本较低，完成度高，由此证明摘除大鼠双侧卵巢的方式是成熟可行的。而CUMS法建立肝郁证模型是目前较为公认的一种造模方式，大鼠在一段时间内受到连续的随机温和负向刺激，来模拟临床郁证患者的生活工作环境，研究发现此种造模方式会使动物出现类似抑郁症的临床表现，如情绪低落，活动减弱等[11]。另有研究发现，CUMS方法建立模型，动物体温出现升高的趋势，而抗抑郁药物地西帕明可以有效降低动物体温，因而认为体温升高和焦虑指数匹配[12-13]，证明该模型可信度较高。且课题组前期多次采用去势法结合CUMS法建立围绝经期综合征肝郁证大鼠模型，成模率较高，造模方法已较为完善和成熟[14-15]。

3.2 围绝经期综合征肝郁证对大鼠行为学的影响 在本研究的行为学实验中，结果显示在各组大鼠的旷场移动总距离、垂直次数以及强迫游泳的相对静止时间在进行CUMS造模之前基本相同，差异无统计学意义。在造模后，模型组的移动总距离显著下降，说明肝郁状态会导致大鼠的活跃程度降低，出现明显的情绪异常;同时大鼠的垂直次数也显著减少，说明大鼠的探索欲下降。在强迫游泳实验中，造模后的大鼠不动时间有延长的趋势。研究表明，抑郁状态下的大鼠会出现行为绝望的表现[16]，这与本研究的实验结果一致。而给予柴胡疏肝散治疗后，大鼠移动总距离和垂直次数均上升，说明柴胡疏肝散可以有效改善大鼠的行为绝望状态，使大鼠活跃度与探索欲回升[17]。

3.3 柴胡疏肝散对大鼠血清性激素水平的影响 近年来，女性围绝经期综合征及相关疾病严重影响到这一阶段妇女的生活质量和健康水平，因而受到人们关注。

围绝经期妇女由于卵巢功能下降会导致内分泌紊乱，睾酮是雄激素的一种，在女性体内分泌，可以调节脂肪在机体的分布并且能促进蛋白质合成[18]。临床研究中围绝经期妇女睾酮水平下降也与本研究的实验结果一致，在柴胡疏肝散进行干预治疗后，大鼠血清中睾酮水平明显上升，说明柴胡疏肝散可以有效改善睾酮的异常分泌情况。

中医药对治疗围绝经期综合征相关疾病的效果尚佳，本研究所使用的的方剂为柴胡疏肝散，为解郁的经典方。过往研究表明柴胡疏肝散在改善围绝经期综合征肝郁证大鼠的抑郁焦虑状态有较好效果[19]。方中柴胡为君药，意在疏肝解郁，调畅情志;香附既能理气又具有较好的止痛效果，川芎既活血又行气，二者相合，功效更甚，此二味共为臣药;陈皮、枳壳、芍药与甘草理气、柔肝，为佐药;另外，甘草调和诸药，因而兼为使药。

根据本研究的结果，在连续灌胃柴胡舒肝散21 d后，可以降低大鼠在旷场实验移动距离，减少直立次数，缩短强迫游泳不动时间，改善大鼠抑郁状态，从行为学角度验证了柴胡疏肝散作为疏肝解郁的经典方剂，具有较好的解郁功效。

综上而言，柴胡疏肝散可以改善围绝经期综合征肝郁证大鼠的行为学表现，提高血清睾酮水平，对围绝经期综合征肝郁证有积极治疗作用，但本研究也存在不足和局限，如其他更多性激素与疾病之间的关系，另外大鼠的抑郁状态可能与多种神经递质变化相关，未来可进行进一步的探索。

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（收稿日期：2021-11-11）