髓系白血病细胞中细胞因子信号转导抑制因子1基因启动子去甲基化对细胞增殖、凋亡的影响

陈 莉, 李青山, 张学强, 任利彬, 索晓慧, 张丛丛

(河北省邯郸市中心医院, 1. 血液内一科, 2. 骨科, 3. 口腔颌面外科, 4. 普外科, 河北 邯郸, 056001)

髓系白血病(ML)是一种具有表型和遗传异质性的恶性血液病[1]。ML是白血病中最常见的类型，病死率高，医疗费用高，给患者及其家属带来较大的经济负担[2]。尽管化疗联合干细胞移植已被证明可有效治疗ML, 但最常见的死亡原因是骨髓衰竭，只有30%～40%的年轻患者和不到20%的老年患者可以实现长期生存[3]。相关研究[4]显示, ML的发生发展与抑癌基因启动子高甲基化密切相关。因此，降低抑癌基因高甲基化状态或可成为治疗ML的一种新策略。细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS-1)是一种肿瘤抑制因子，在肝癌和急性髓系白血病(AML)中都发现了该基因启动子区域DNA高甲基化而导致SOCS-1沉默的现象[5]。但SOCS-1基因启动子去甲基化对ML细胞增殖、凋亡的影响尚不完全清楚。本研究利用地西他滨(DCA)构建SOCS-1去甲基化的U937细胞系，研究SOCS-1去甲基化对U937细胞增殖、凋亡的影响，旨在为ML的治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 ML骨髓标本和细胞系

选取2018年3月—2020年3月在邯郸市中心医院收集的78例ML患者的骨髓标本作为实验组，另外收集50例健康捐献者的骨髓标本作为对照组，所有ML患者均为首次在邯郸市中心医院确诊为ML, 且未接受任何治疗。该研究得到邯郸市中心医院临床研究伦理委员会批准，所有研究对象均知情并自愿签署知情同意书。人ML细胞系U937、HL-60、K562和人骨髓基质细胞HS-5购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂与仪器

莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶购自上海雅吉生物科技有限公司; 胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基、BCA试剂盒均购自美国Bio-Rad公司; TransStart®Green qPCR SuperMix购自TaKaRa公司; 总蛋白提取试剂盒购自艾美捷科技有限公司; Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司; CCK-8试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司; SOCS-1、β-actin兔多克隆抗体(anti-SOCS-1、anti-β-actin)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗均购自美国Abcam公司; 荧光定量PCR仪购自美国ABI公司, CO2培养箱购自上海知楚仪器有限公司。

1.3 细胞培养与处理

采用含有10% FBS的RPMI 1640培养基培养人ML细胞系U937、HL-60、K562和人骨髓基质细胞HS-5, 所有细胞均在37 ℃、5% CO2的培养条件下培养。取对数生长期的U937细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL, 接种于6孔板中，培养过夜，参照文献[6]及前期预实验结果用0、0.8、1.6、3.2 μmol/L DCA分别处理U937细胞，并分别命名为空白组、DCA-L组(DCA低剂量)、DCA-M组(DCA中剂量)、DCA-H组(DCA高剂量)，每组设置6个复孔。

1.4 甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)检测SOCS-1基因启动子甲基化状态

采用苯酚氯仿法抽提ML骨髓标本和各组U937细胞的DNA, 紫外分光光度计用于检测DNA的纯度。将4 μL DNA与40 μL去离子水混合，加入10 μL 氢氧化钠(NaOH)溶液(3 mol/L)于37 ℃下孵育20 min, 再加入30 μL对苯二酚(10 mmol/L)与520 μL亚硫酸氢钠(1.5 mol/L)于50 ℃下孵育16 h。利用DNA纯化试剂盒回收DNA, 最后再加入50 μL NaOH溶液(1 mol/L), 室温静置5 min以终止修饰，利用无水乙醇沉淀DNA, 经离心干燥后，加入15 μL去离子水保存于-20 ℃环境中。亚硫酸氢钠处理的DNA用甲基化特异性或非甲基化特异性引物扩增，反应程序为: 95 ℃预变性10 min; 95 ℃ 20 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 40个循环; 72 ℃ 10 min进行最后的延伸步骤。聚合酶链式反应(PCR)产物在3%琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙锭染色并在紫外线照射下观察目的条带。判断甲基化标准: ① 完全甲基化，甲基化引物扩增出现阳性条带，非甲基化引物未扩增出条带; ② 部分甲基化，甲基化引物、非甲基化引物均扩增出阳性条带; ③ 非甲基化，甲基化引物未扩增出现阳性条带，非甲基化引物扩增出阳性条带。完全甲基化、部分甲基化均为甲基化阳性。所用引物序列见表1。

表1 SOCS-1基因启动子区域甲基化引物(SOCS-1 M)与非甲基化引物(SOCS-1 U)

1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SOCS-1 mRNA表达水平

Trizol试剂用于从ML患者骨髓及ML细胞中分离总RNA。利用MMLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA。利用TransStart®Green qPCR SuperMix在荧光定量PCR仪上对SOCS-1进行扩增反应，以GAPDH为内参，通过2-△△CT方法计算SOCS-1mRNA相对表达水平。所用引物序列为:SOCS-1正向5′-TGCGCCTCAAGACCTTCAG-3′, 反向5′-CATCAGGCTCTCGCTTTTGGA-3′;GAPDH正向5′-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3′, 反向5′-GGTGGAATCATATTGGAACA-3′。

1.6 Western blot检测SOCS-1蛋白表达水平

利用总蛋白提取试剂盒提取ML患者骨髓及各组细胞的总蛋白。使用BCA试剂盒测量总蛋白质浓度。利用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离40 μg蛋白质，并电印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使用5%脱脂牛奶封闭膜，再加入一抗anti-SOCS-1(1∶2 000)、anti-β-actin(1∶3 000)于4 ℃下孵育过夜，第2天将膜用洗膜缓冲液(TBST)洗涤后，加入HRP标记的羊抗兔二抗，于37 ℃下孵育1 h, 使用ECL发光试剂盒观察蛋白质的显色情况，以β-actin为内参，利用Image J分析蛋白质条带灰度值。

1.7 CCK-8法检测细胞增殖情况

将各组细胞以5×103个/孔的密度接种到96孔板中。在DCA处理24、48、72 h时，分别向每个孔中加入10 μL CCK-8试剂，在37 ℃下孵育4 h后，使用酶标仪测量450 nm处光密度值(OD450 nm)。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡情况

将各组细胞以5×104个/孔的密度接种到6孔板中，在DCA处理48 h后收集各组细胞。在室温下将各组细胞与膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶染色试剂避光孵育15 min后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 SOCS-1基因启动子甲基化状态

50例对照标本中,SOCS-1基因启动子甲基化阳性率为0%, 78例ML患者标本中SOCS-1基因启动子甲基化阳性率为83.33%, 差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 SOCS-1 mRNA及SOCS-1蛋白在ML患者及细胞系中的表达水平

SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白在实验组中表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05), 见图1、表2。人ML细胞系U937、HL-60、K562中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表达低于人骨髓基质细胞HS-5，且U937细胞中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表达水平最低，差异有统计学意义(P<0.05)。因此，以U937细胞为研究对象进行后续实验，见图2、表3。

图1 Western blot检测SOCS-1蛋白表达

表2 SOCS-1 mRNA及SOCS-1蛋白在ML患者和健康者中的表达水平

A: HS-5细胞; B: U937细胞; C: HL-60细胞; D: K562细胞。图2 Western blot检测ML细胞系中SOCS-1蛋白表达

表3 SOCS-1 mRNA及SOCS-1蛋白在ML细胞系中的表达水平

2.3 DCA对U937细胞SOCS-1甲基化状态及SOCS-1表达的影响

MS-PCR结果显示,SOCS-1在空白组U937细胞中呈高甲基化状态，经不同浓度的DCA处理后,SOCS-1的甲基化水平降低，且DCA浓度越高,SOCS-1的甲基化水平越低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。qRT-PCR和Western blot结果表明，与空白组比较, DCA-L组、DCA-M组、DCA-H组中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表达升高，且DCA浓度越高,SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表达水平越高，差异有统计学意义(P<0.05), 见图4、表4。

A: 空白组; B: DCA-L组; C: DCA-M组; D: DCA-H组。图3 MS-PCR检测DCA对U937细胞SOCS-1甲基化状态的影响

A: 空白组; B: DCA-L组; C: DCA-M组; D: DCA-H组。图4 Western blot 检测各组细胞中SOCS-1蛋白表达

表4 DCA对U937细胞中SOCS-1 mRNA及SOCS-1蛋白表达的影响

2.4 各组细胞增殖能力比较

与空白组比较, DCA-L组、DCA-M组、DCA-H组U937细胞OD450 nm值(24、48、72 h)降低，且DCA浓度越高, U937细胞OD450 nm值(24、48、72 h)越低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

2.5 各组细胞凋亡率比较

与空白组比较, DCA-L组、DCA-M组、DCA-H组U937细胞凋亡率升高，且随着DCA浓度的升高，细胞凋亡率逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05), 见图5、表6。

表5 各组细胞OD450 nm值(24、48、72 h)比较

A: 空白组; B: DCA-L组; C: DCA-M组; D: DCA-H组。图5 流式细胞术检测各组细胞凋亡

3 讨 论

ML是一种造血干细胞恶性克隆性疾病，其特征是未成熟髓系祖细胞的增殖失控和凋亡受阻[7]。相关研究[8]表明，遗传异常和表观遗传改变在ML的发病机制中起着至关重要的作用。DNA甲基化异常是ML中最常见的表观遗传变化，该过程未涉及DNA序列改变，主要是通过在转录前对染色体进行结构修饰，从而影响基因功能[6]。研究[9]证明, DNA低甲基化和高甲基化在肿瘤发展中经常发生; 基因启动子区域CpG岛的高甲基化通常与肿瘤抑制基因的失活有关[10]; 在造血系统疾病中，异常的DNA高甲基化被证明与白血病的发生有关[11]。而作为DNA甲基化的关键效应物DNA甲基转移酶(DNMT), 其具有催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移到胞嘧啶5′位上，在DNA甲基化的发生中具有重要作用[12]。因此，从抑制DNMT的角度出发，来减弱DNA甲基化成为近年来研究治疗ML的热门话题。

表6 各组细胞凋亡率比较

SOCS-1是位于染色体16p13.3上的可编码211个氨基酸的基因，其能通过直接与Janus激酶相互作用，负向调节细胞因子信号转导通路[13]。据研究[14]报告，由于启动子甲基化，SOCS-1在许多癌症中呈低表达状态;SOCS-1基因在成人AML中甲基化水平明显增高，且SOCS-1基因甲基化后其mRNA表达水平受到抑制[15];SOCS-1基因启动子区域甲基化可促进肝癌细胞的增殖和转移[16]。本研究结果表明, ML患者标本中SOCS-1基因启动子甲基化阳性率为83.33%, 显著高于健康对照组，且ML患者标本中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表达水平显著降低，提示SOCS-1在ML中呈高甲基化状态，且SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表达受到抑制; 本研究还通过qRT-PCR检测发现人ML细胞系U937、HL-60、K562中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表达显著低于人骨髓基质细胞HS-5, 且U937细胞中SOCS-1mRNA及SOCS-1蛋白表达水平最低，因此以U937细胞为研究对象进行后续实验。

DCA是一种新型表观遗传药物，在体内磷酸化后进入DNA，通过抑制DNMT的活性，诱导DNA去甲基化，从而激活因启动子区域甲基化而沉默抑癌基因的表达[17]。相关研究[18]证实, DCA适用于不适合高剂量治疗的老年人和移植患者，已成为老年AML患者的一线治疗药物; 体外应用DCA有助于抑制hPer3基因甲基化，进而诱导hPer3基因表达和促进AML细胞凋亡[19]; DCA可抑制SHP-1基因甲基化，进而抑制骨髓增生异常综合征细胞的增殖，诱导其凋亡[20]。为了进一步研究SOCS-1去甲基化对U937细胞增殖、凋亡的影响，本研究利用0.8、1.6、3.2 μmol/L DCA构建SOCS-1去甲基化的U937细胞系，结果表明SOCS-1在空白组U937细胞中呈高甲基化状态，经不同浓度的DCA处理后,SOCS-1的甲基化水平显著降低，且DCA浓度越高，SOCS-1的甲基化水平越低，提示SOCS-1去甲基化的U937细胞系构建成功。此外，经DCA处理后, U937细胞的增殖能力降低，凋亡能力增强，且DCA浓度越高，这种趋势越显著，提示SOCS-1去甲基化可抑制U937细胞增殖、促进细胞凋亡，这与张晓慧等[21]研究结果相一致，其研究表明在AML中通过将DNMT基因敲除可将SOCS-1基因去甲基化，上调SOCS-1基因表达，进而抑制肿瘤发展，促进肿瘤细胞凋亡。

综上所述,SOCS-1去甲基化可抑制U937细胞增殖、促进细胞凋亡。因此，从降低SOCS-1甲基化角度来研究治疗ML可能成为一个新的策略。