高效液相色谱-质谱联用仪检测奶粉中倍他米松残留量的方法研究

智丽慧

（上海妙可蓝多食品科技股份有限公司，上海 201506）

糖皮质激素（Glucocorticoids，GCs）是一类甾体激素，又名“肾上腺皮质激素”，能够调节糖、脂肪和蛋白质等成分的合成和代谢，临床上广泛应用于治疗皮肤过敏性及炎症性疾病，且糖皮质激素能提高饲料转化率，促进动物生长而被用于动物养殖[1]。倍他米松作为糖皮质激素重要成员，具有消炎、抗病毒、促进泌乳等多种功效，倍他米松为地塞米松的同分异构体，作用与用途同醋酸地塞米松，其钠水潴留作用及剂量都比后者小，在奶牛养殖业中被大量使用[2]。

质谱技术起源于19世纪英国学者汤普森发明的质谱仪，当时是用于检测分子质量差异，分辨率较低；随着质谱仪技术的提升，分辨率逐步提高，当高效液相色谱技术和质谱技术联用后，既有高效液相色谱技术对复杂化合物的良好分离能力，又综合了高分辨率质谱对化合物的准确定性和定量，还可在很大程度上缩减分析时间。高效液相色谱和质谱联用技术优势明显，可实现多种化合物的同时测定，检测结果的灵敏度高、准确性好，广泛应用于食品、药品等检测领域[3]。

在食品检测行业中，高效液相色谱-质谱法可以准确高效地测定乳制品中三聚氰胺含量、农药残留量、兽药残留量、食品添加剂含量和毒素含量，其检测速度快，定性、定量分析的准确性高，该方法补齐了常规检测方法的短板，在食品安全检测中的应用越来越广，但还有很大的技术应用空间。目前，倍他米松的主要检测方法是农业部1031号公告-2-2008《动物源性食品中糖皮质激素类药物多残留检测 液相色谱-串联质谱法》[4]。多组分同时处理时，倍他米松回收率偏低，本研究通过优化前处理方法、色谱条件、改进标准曲线，采用高效液相色谱串联质谱进行快速筛查，以期对乳制品中倍他米松筛查和确证提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

购买不同到货批次的全脂奶粉20批；倍他米松标准物质（CAS：378-44-9，纯度大于等于99%）；甲醇、甲酸、乙腈，均为色谱纯；试验用水为GB/T 6682—2008规定的一级水。

1.2 仪器与设备

Waters TQD型串联四级杆质谱仪，配Waters高效液相色谱仪、自动进样器、电喷雾离子源；Oasis HLB cartridge固相柱（3 mL/60 mg）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

使用直接称量方式称取1 g奶粉样品（精确到0.01 g）于50 mL具塞离心管中，再向上述具塞离心管中加入约45 ℃ 10 mL水，漩涡1 min使奶粉样品完全溶解成匀液。再向具塞离心管中加入20 mL乙腈，涡旋混匀1 min，以≥5 000 r/min离心10 min，使用一次性移液管取上清液至旋转蒸发瓶中，将蒸发瓶安装在旋转蒸发仪上，使用45 ℃水浴减压蒸发，将上清液浓缩至体积小于5 mL。再将浓缩后的提取液全部转移至经活化的C18固相萃取柱，用5 mL水少量多次洗涤旋转蒸发瓶和萃取柱，萃取柱在负压下减压抽干1 min，流出液全部弃去。使用5 mL乙腈作为洗脱剂，以≤3 mL/min流速进行洗脱，使用玻璃试管收集洗脱液，将玻璃试管置于45 ℃水浴中用氮气吹干，再向玻璃试管中加入0.50 mL流动相，漩涡溶解残渣，用0.22 μm的滤膜过滤待测定。

1.3.2 标准溶液配制

倍他米松标准储备溶液：称取（100±1）mg倍他米松标准物质，用甲醇进行溶解，分少量多次将溶解液体转移到100 mL容量瓶并定容，配成浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液。倍他米松标准中间工作溶液：吸取适量的倍他米松标准储备溶液，用甲醇配成1 μg/mL标准中间工作溶液。

倍他米松标准系列工作液：分别吸取20 μL、50 μL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL倍他米松标准中间工作溶液，用甲醇定容至100 mL，配制成浓度为0.2 μg/L、0.5 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L和10.0 μg/L的系列工作液

1.3.3 仪器条件

（1）液相色谱条件。色谱柱：XBridge C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.5 μm）；流动相：乙腈+0.1%甲酸溶液（1+1）；流速：200 μL/min；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

（2）质谱条件。电喷雾离子源ESI+，毛细管电压2.6 kV，离子源温度110 ℃，锥孔反吹气流量35 L/h，脱溶剂气温度300 ℃，脱溶剂气流量750 L/h。第一重四极杆和第二重四极杆的低端分辨率及高端分辨率均为15。

2 结果与分析

2.1 提取条件的优化

本研究比较以乙腈和乙酸乙酯为提取剂提取试样中倍他米松。选择4组阴性基质样品，分别向上述4组样品中添加2 μL、3 μL、5 μL和10 μL标准中间工作溶液制备成浓度为2 μg/kg、3 μg/kg、5 μg/kg和10 μg/kg的加标样品，每组2个平行，分别使用乙腈和乙酸乙酯为提取剂，提取结果见表1。结果表明以乙酸乙酯为提取剂，倍他米松回收率偏低，无法达到《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）附录F回收率范围的要求[5]；以乙腈为提取剂进行提取时，由于乙腈具有使蛋白质变性的特性，提取效果好，回收率结果符合要求。故采用乙腈作为提取剂，能够有效去除蛋白质等，有利于下一步的净化与浓缩。

表1 不同提取剂提取倍他米松的结果对比表

2.2 线性关系

按仪器工作条件及优化后条件对倍他米松标准系列工作液进行测定，以标准溶液浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。倍他米松在0.2～10.0 μg/L线性良好，线性回归方程为y=1.336x-1.179，相关系数为0.999 7。

2.3 方法检出限

采用经确认为阴性的基质样品，添加一定浓度的标准溶液，样品按照1.3方法处理并测定，以大于3倍和10倍信噪比时对应的质量浓度计算检出限和定量限。倍他米松的检出限为2 μg/kg，定量限为5 μg/kg。

2.4 准确性试验

分别称取5份奶粉样本，1份作为试样本底，分别在另外4份中添加不同量倍他米松标准溶液，制备成理论添加量分别为2 μg/kg、3 μg/kg、5 μg/kg和10 μg/kg的加标样品，对5份试样测定，方法的平均回收率为65.0%～86.0%，方法回收率在60%以上，可满足检测要求，结果见表2。

表2 倍他米松加标回收率结果

2.5 精密度试验

选取倍他米松未检出的阴性试样，按照1.3.1方法称取24份试样，分为4组，每组6个平行，每组添加不同浓度的标准溶液，进行测定，相对标准偏差为3.29%～13.76%，方法的精密度在15%以内，可满足检测要求，结果见表3。

表3 精密度试验结果

2.6 实际样品的测定

对20批奶粉样品用优化后方法进行检测，同时附带加标回收的质量控制方式，在回收率符合的情况下，奶粉试样结果均未检出。

3 结论与讨论

本文建立了奶粉中倍他米松的高效液相色谱-质谱检测法。基于《牛奶和奶粉中地塞米松残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（GB/T 22978—2008）[6]的前处理步骤，该方法优化了前处理条件，使用乙腈作为提取剂，检出限和定量限均符合国家标准要求，曲线线性表现良好，回收率和精密度也均符合国家标准要求，同时应用奶粉实际样品检测过程未发现异常。因此，该方法可适用于奶粉中倍他米松的筛查测定；另外该方法应用的提取剂与测定奶粉中地塞米松残留量的提取剂一致，可进一步扩展应用奶粉中地塞米松和倍他米松的同时测定。