平欧榛子分离蛋白提取条件优化

2022-05-17魏雅静祝开阳

食品安全导刊 2022年11期

魏雅静，杨宇，祝开阳

（阜新市产业技术创新推广中心（阜新市产业技术研究院），辽宁阜新 123000）

榛子是世界四大干果之一，营养丰富，果仁中含有B族维生素、人体必需氨基酸、多种矿物质元素、高含量蛋白质和丰富的脂肪等成分[1]。平欧榛子是由平榛与欧洲榛种间杂交产生的新品种，具有果大、丰产、抗寒性强和果仁质量好等特点[2]。

常用的蛋白质提取方法有水溶液提取、碱溶酸沉[3]、有机溶剂提取及酶法提取等。其中碱溶酸沉法由于操作简单、容易控制、成本低廉应用最广泛，且所得产品蛋白质含量较高，经济实用性强，因此试验采用碱溶酸沉法提取平欧榛子蛋白质，以蛋白提取率为指标，得到榛子分离蛋白最佳提取条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

平欧榛子，购于本溪县三阳大果榛子专业生产合作社。考马斯亮蓝G-250，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；牛血清白蛋白，北京奥博星生物技术有限责任公司；盐酸、氢氧化钠、硫酸、甲基红、溴甲酚绿、乙醇、石油醚（30～60 ℃）和正己烷均为分析纯，购于国药集团。

1.2 仪器与设备

pHS-25数显pH计，上海精密科学仪器有限公司；TDL-40B台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏饰演设备有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；FD-IC-80高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有公司；SHA-C恒温振荡器，国华电器有限公司；DSA30-TM1超声波清洗器，福州德森精工有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

去壳后的榛仁室温静水浸泡15 h，去皮，50 ℃烘箱烘干，粉碎机破碎后过40目筛。料液比1∶5（g∶mL）加入正己烷，50 ℃超声波提取30 min，4 000 r/min离心20 min，倒去正己烷（回收利用），残留的正己烷在通风橱中挥发，按照上述步骤重复提取一次得到榛子脱脂粉，放入-20 ℃冰箱中备用。

1.3.2 可溶性蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝测定可溶性蛋白质含量[4]。配制不同浓度梯度的标准蛋白质（Bovine Serum Albumin，BSA）溶液，加入考马斯亮蓝G-250充分混合，在595 nm处测吸光值，绘制蛋白质标准曲线，计算回归方程，利用回归方程求出样品蛋白质含量。

1.3.3 榛子分离蛋白的制备

榛子分离蛋白的制备采用碱溶酸沉法。脱脂榛子粉与去离子水以一定比例混合均匀，用1 mol/L的NaOH调节pH，在恒温振荡水浴中浸提一段时间，5 000 r/min离心20 min，收集上清液，用1 mol/L HCl调至等电点5 000 r/min离心20 min，弃上清液，冷冻干燥得榛子分离蛋白[5]。榛子蛋白质提取率计算：

式中：M为脱脂榛子粉质量，g；Mt为上清液中蛋白质含量，g；C为脱脂榛子粉中蛋白质含量，%。

1.3.4 单因素试验

以蛋白质提取率为指标，对影响蛋白质提取率的主要因素pH（7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0），温度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃），时间（30 min、40 min、50 min、60 min、70 min和80 min），料液比（1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30）（g∶mL）进行单因素试验。基础水平设置为pH为9.0、温度50 ℃、提取时间60 min、料液比1∶15（g∶mL）。

2 结果与分析

2.1 蛋白质回归方程

如图1所示，利用蛋白质标准曲线计算回归方程为y=6.72x+0.149，R2=0.996 9，表明方程线性拟合度良好，可以运用此方程作为测定蛋白质含量的依据。

图1 蛋白质含量标准曲线

2.2 榛子分离蛋白提取工艺单因素分析

2.2.1 pH值对榛子分离蛋白提取率的影响

如图2所示，在pH在7.5～9.0，随着pH的升高，蛋白提取率逐渐升高，这可能是因为碱液使蛋白质中的部分化学键尤其是氢键遭到破坏，基团解离，导致蛋白质中紧密结构变得松散，促进蛋白质分子的溶出[6]。当pH为9.0时，提取率达到最高值为72.77%。之后蛋白质提取率明显下降，这可能是因为高pH环境会使氨基酸残基发生异构化，形成外旋混合物，同时碱性过高会导致蛋白质发生变性，水溶性降低。因此提取榛子分离蛋白最佳pH为9.0。

图2 pH值对榛子分离蛋白提取率的影响

2.2.2 温度对榛子分离蛋白提取率的影响

如图3所示，35～50 ℃条件下，随着温度的升高，蛋白提取率呈上升趋势，当温度为50 ℃时，达到最高值为73.15%。这可能是因为温度较低时蛋白质分子和水分子不能充分进行相互作用，温度逐渐上升，二者之间相互作用加强，蛋白质的溶解度随之提高，提取率也相应提高。50 ℃以后蛋白提取率与温度呈负相关，这可能是因为过高的温度使部分蛋白质发生变性而聚集沉淀，影响蛋白质溶出率，且高温可能会增强榛子脱脂粉中碳水化合物等成分的黏性，促使其与蛋白质发生黏合，从而使榛子分离蛋白的提取率下降[7]。因此提取榛子分离蛋白最佳温度为50 ℃。

图3 温度对榛子分离蛋白提取率的影响

2.2.3 提取时间对榛子分离蛋白提取率的影响

如图4所示，当提取时间从30 min增加到60 min，蛋白提取率明显提高，从54.42%提高到72.14%，这是因为在初提阶段，榛子分离蛋白没有完全溶解，随着提取时间的延长，蛋白的溶出量逐渐增加，提取时间为60 min时蛋白溶出接近饱和状态，增加提取时间，也只能溶出很少的蛋白质。因此，后来随着提取时间的延长，榛子分离蛋白的提取率增加缓慢，并且提取时间过长，产品卫生质量受到影响，为了保证产品质量、节约能源、降低成本，确定最佳提取时间为60 min。

图4 提取时间对榛子分离蛋白提取率的影响

2.2.4 料液比对榛子分离蛋白提取率的影响

如图5所示，当料液比（g∶mL）在1∶8～1∶15，提取率增长速度较快，当料液比为1∶15（g∶mL）时达到73.89%。这可能是因为当料液比较小时，溶液的黏度大，分子间的阻力比较大，影响蛋白质的溶出速率，随着料液比的增加，水分子与蛋白质分子接触面积增大，从而促进了蛋白质的溶解。之后，随着料液比的继续增加，蛋白质的提取率增加缓慢。这可能是因为大部分蛋白质已经基本溶出，在现有的条件下，即使料液比继续提高，对蛋白质的溶解也无明显提高的作用。陶健[8]在荞麦蛋白的制备中发现，料液比较大时，在酸沉过程中有大量蛋白质从粗蛋白母液流失到乳清中，若母液中蛋白质浓度过低，会使酸沉现象不发生，并且料液比过大会增加生产成本，考虑到节省资源、降低成本和保证酸沉工序正常进行，以料液比1∶15（g∶mL）作为最佳提取蛋白的比例。