不同发育历期褐飞虱脂肪体与肠道内共生菌数量的变化

熊振泽,史嘉腾,宋阳,申屠旭萍,俞晓平

(中国计量大学 生命科学学院 浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江 杭州 310018)

褐飞虱(NilaparvatalugensStål)属半翅目飞虱科(Homoptera: Delphacidae),是一种只以水稻或野生稻为食的迁飞性害虫,是亚洲稻区的重要害虫[1]。褐飞虱脂肪体和肠道内存在大量共生菌,主要包括共生真菌和共生细菌,这些共生菌与褐飞虱相互依存相互影响,褐飞虱为共生菌提供了适宜的生存环境,共生菌对褐飞虱的生长、发育、营养代谢、抗性变异以及免疫功能等具有重要的作用,缺失共生菌会直接导致褐飞虱生长、发育延缓,繁殖能力丧失,以及过早死亡[2-4]。

基于褐飞虱和共生菌间的紧密关系,越来越多的研究聚焦于不同处理后共生菌在褐飞虱体内的变化,旨在进一步阐明共生菌对宿主褐飞虱的影响,如取食抗性和无抗性水稻品种后褐飞虱肠道内共生菌的多样性差异分析以及杀菌剂处理后褐飞虱脂肪体和肠道内共生菌数量变化等研究[3-5]。目前共生菌多样性分析主要采用高通量测序分析方法,共生真菌主要以18S rDNA、ITS序列,共生细菌则以16S rDNA作为扩增子进行多样性分析,但是检测的结果只能体现某类或某种共生菌在宿主体内的相对丰度变化,并不能比较处理前后该类菌或该种菌绝对量的变化[5]。针对共生菌定量的检测,目前主要采用血细胞计数板法和荧光定量方法对褐飞虱脂肪体内主要共生真菌—类酵母共生菌(Yeast-like symbiotes, YLS)的数量测定[6-7]。血细胞计数法简捷、直观,但是由于计数室中只能容纳0.1 mL的样品,而褐飞虱个体间差异相差较大,因此由于取样量少导致实验结果并不能反映真实情况。荧光定量PCR具有高特异性、高灵敏性的优点,但同时对反应条件以及引物的要求较严格。近几年,已有采用荧光定量PCR的方法检测褐飞虱组织中特定共生菌数量的研究[7],但是由于褐飞虱体内共生菌种类还未完全阐明,因此较少能采用该方法检测菌的种类。针对个体较小的共生细菌,相关的数量测定未见报道。

为了探明不同条件处理下褐飞虱体内共生细菌和共生真菌的总的数量变化,急需建立通用的共生菌的数量测定方法。在此,我们分别以褐飞虱脂肪体和肠道内的共生细菌和共生真菌为研究对象,基于ITS和16S rDNA序列构建了实时荧光定量PCR检测体系,并检测了不同发育历期褐飞虱脂肪体和肠道内共生菌总数量,为后续研究褐飞虱和共生菌间的关系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

褐飞虱虫源采自浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室人工气候室,以TN1敏感品系水稻苗连续饲养,饲养条件为:温度(26±1)℃,湿度70%～80%,光周期16L∶8D。

1.2 主要试剂

DNA抽提试剂=25∶24∶1(P1012)购自北京索莱宝科技有限公司;TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 试剂盒、Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0)试剂、pMDTM19-T Vector Cloning Kit试剂盒、TB Green®Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)、PrimeScriptTM1 st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司;SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit试剂盒、SanPrep Column PCR Product Purification Kit试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 引物合成

本研究采用细菌16S rDNA通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-

GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′);真菌ITS通用引物ITS3F(5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′)和ITS4R(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′);褐飞虱肌动蛋白β-Actin引物通过Primer Premier 5.0软件对NCBI(美国国立生物技术信息中心)已公布的序列进行设计:ActinF(5′-GATGAGGCGCAGTCAAAGAG-3′)和ActinR(5′-GTCATCTTCTCACGGTTGGC-3′)。

1.4 质粒标准曲线构建

1.4.1 重组质粒的制备

分别以338F-806R和ITS3F-ITS4R引物通过菌落PCR扩增了大肠杆菌(Escherichiacoli)16S rDNA V3-V4区以及酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)ITS2序列。利用CTAB法提取褐飞虱基因组DNA,以ActinF-ActinR为引物扩增褐飞虱β-Actin序列,PCR产物纯化后连接到载体pMD19-T上,然后转化到JM109感受态细胞中。转化完成分别以338F-806R、ITS3F-ITS4R和ActinF-ActinR引物进行菌落PCR以确认产物片段和插入片段一致。确认后挑取阳性克隆于液体LB培养基中培养12 h,所得菌液利用SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit试剂盒提取质粒DNA,用于测序以及制备标准品。

1.4.2 标准曲线样品的制备与定量PCR检测

以紫外分光光度计检测两种质粒DNA质量浓度,分别根据质粒质量浓度与质粒bp数计算质粒拷贝数。以质量浓度为1×1010拷贝数的质粒为母液,依次10倍稀释至1×106拷贝数。将上述5个质量浓度梯度的质粒进行实时荧光PCR扩增,然后根据拷贝数和Ct值制作标准曲线。

1.5 不同发育历期褐飞虱肠道与脂肪体细菌、真菌的定量检测

1.5.1 褐飞虱肠道和脂肪体收集

取温室人工饲养传代10代以上的3龄、4龄、5龄若虫以及羽化后2 d、6 d的雌、雄虫各100头,在体视镜下将褐飞虱肠道与腹部小心分离,并进一步用无菌磷酸盐缓冲液漂洗得到表面干净的褐飞虱肠道,再将雌成虫腹部卵巢组织、雄成虫精囊、若虫未发育完全器官组织等肉眼可辨的器官以及腹部表皮和头胸足去除,剩下的组织作为脂肪体收集。

1.5.2 不同发育历期褐飞虱肠道细菌与真菌定量检测

取1.5.1解剖得到的不同发育历期褐飞虱肠道进行匀浆,再按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明提取总RNA,提取的RNA按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录得到褐飞虱总cDNA第1链。将cDNA稀释10倍后分别以338F-806R、ITS3F-ITS4R和ActinF-ActinR为定量引物进行荧光定量检测。每个处理重复3次。荧光定量PCR检测的反应体系(20 μL)为TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,正反引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ROX REFERENCE Dye II(50×)0.4 μL,DNA模板2 μL,无菌水6.8 μL。荧光定量PCR循环条件:95 ℃ 30 s;然后95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环。

1.5.3 不同发育历期褐飞虱脂肪体细菌与真菌定量检测

取1.5.1解剖得到的不同发育历期褐飞虱脂肪体以1.5.2的方法提取总RNA和合成cDNA第1链。然后以338F-806R、ITS3F-ITS4R和ActinF-ActinR为定量引物对样品进行荧光定量检测。每个处理3次重复。

1.6 数据分析

以实时荧光定量PCR仪检测到的标准样品Ct值为纵坐标,标准品质粒起始拷贝数的对数值为横坐标,绘制标准曲线。为了降低在RNA提取以及反转录过程中每组样品的提取率存在差异而产生的误差,将肠道或脂肪体细菌16S、真菌ITS序列Ct值对应的拷贝数与对应样品的β-Actin序列的Ct值对应的拷贝数作比,再对不同处理的比值采用SPSS22.0进行单因素方差分析ANOVA,差异分析采用Tukey法进行验证(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同发育历期褐飞虱肠道和脂肪体总RNA提取和cDNA第1链合成

由于3、4龄褐飞虱若虫体型较小,获取肠道难度较大,因此只收集了5龄以及羽化后2 d、6 d雌、雄虫肠道;各龄期的脂肪体均成功提取。经紫外分光光度计检测每个样品总RNA的A260/A280比值均在1.8～2.0之间,质量浓度在600～1 000 ng/μL之间,说明提取的总RNA纯度好、完整度高,可作为反转录模板。反转录所得cDNA第1链经紫外分光光度计检测质量浓度均在1 200～1 300 ng/μL之间。

2.2 质粒标准曲线构建

将提取得到的重组质粒进行PCR扩增,目的条带单一明亮,测序后比对发现序列覆盖率100%,说明质粒重组成功。

结果表明,标准品的拷贝数以10为底的对数值与检测到荧光信号的循环数呈线性关系,其相关系数分别为0.995 4(16S);0.996 5(ITS);0.997 8(Actin)(图1),说明所制备的标准曲线可以用于褐飞虱共生细菌16S、共生真菌18S以及虫体β-Actin在各个样品中表达量的绝对定量检测。

图1 褐飞虱β-actin、大肠杆菌16S、酿酒酵母ITS质粒标准曲线Figure 1 Plasmid standard curve of Escherichia coli 16 s rDNA, Saccharomyces cerevisiae ITS and BPH β -actin sequence

2.3 不同发育历期褐飞虱细菌与真菌定量检测

2.3.1 不同发育历期褐飞虱肠道细菌与真菌定量检测

由于各个样品存在解剖过程以及总RNA提取时产生的误差,因此以褐飞虱肠道细菌16S、真菌ITS拷贝数与褐飞虱虫体β-Actin的拷贝数的比值来表示单位虫体共生菌数量。不同发育历期褐飞虱肠道共生菌数量的变化如图2所示。结果表明,同一龄期褐飞虱肠道细菌数量远大于肠道真菌。褐飞虱羽化后2 d的雌、雄虫肠道细菌含量与5龄若虫相比均显著减少,而随着羽化天数增加,雌虫的肠道细菌数量显著增加,而雄虫无显著变化。对于共生真菌,褐飞虱羽化后2 d雌、雄虫肠道共生真菌数量较5龄若虫同样显著减少,而随着羽化天数增加至6 d褐飞虱雌虫肠道共生真菌数量又显著增加至与5龄若虫同一水平,雄虫则不随羽化天数增加而发生改变。

注:不同小写字母表示褐飞虱不同发育阶段肠道内共生细菌或共生真菌总的数量存在显著差异(P<0.05)图2 不同发育历期褐飞虱肠道共生菌的数量变化Figure 2 Change of gut endosynbionts number in BPH with different developmental stages

2.3.2 不同发育历期褐飞虱脂肪体细菌与真菌定量检测

不同发育历期褐飞虱脂肪体共生菌数量的变化如图3所示。结果表明,褐飞虱脂肪体共生细菌数量也均大于共生真菌,但相比肠道差异较小。褐飞虱5龄若虫的单位脂肪体共生菌含量均显著少于3龄若虫,羽化后2 d的褐飞虱雄虫共生细菌含量显著高于5龄若虫期,羽化后6 d的雄虫单位脂肪体共生细菌含量相比2 d反而显著减少,而雌虫随着羽化天数的增加逐渐增加;羽化后2 d的褐飞虱雌虫单位脂肪体共生真菌含量显著增加,而随着羽化天数的增加,羽化后6 d雌虫单位脂肪体共生真菌含量反而显著减少,雄虫则随着羽化天数增加无显著变化。

注:不同小写字母表示褐飞虱不同发育阶段脂肪体内共生细菌或共生真菌总的数量存在显著差异(P<0.05)图3 不同发育历期褐飞虱脂肪体共生菌数量的变化Figure 3 Change of fat body endosynbionts number in BPH with different developmental stages

3 结 语

本研究发现,对于褐飞虱肠道共生菌,无论是雌虫与雄虫在5龄至羽化后2 d之间肠道共生菌数量均有显著减少,这可能是由于褐飞虱从5龄到羽化过程中个体发育导致虫体增长,而肠道内共生菌增殖的速度低于个体发育;而羽化后2 d至羽化后6 d仅雌虫肠道共生菌含量显著增加,雄虫则无明显变化,这可能由于褐飞虱作为单食性害虫无法通过自身肠道直接消化水稻汁液,需要通过肠道共生菌群参与才能够为褐飞虱生命活动提供以碳源为主的能量物质[8],而褐飞虱雌虫在羽化后2 d至6 d时由于进入产卵期需要大量的能量,因此取食量的增加可能导致需要更多的肠道共生菌来参与消化水稻汁液,所以菌的数量急剧增加。

对于褐飞虱脂肪体共生菌,5龄若虫单位脂肪体的共生菌含量显著低于3龄若虫,这可能同样是由于虫体发育迅速,而共生菌增殖速度相比较慢,而在羽化后2 d雄虫脂肪体共生细菌含量显著增加,随着羽化天数增加又显著减少,这可能与褐飞虱雄虫在羽化后2 d刚度过生殖前期并且雄虫的繁殖力随羽化天数的增加而减弱有关,具体脂肪体共生菌对雄虫繁殖力的影响还有待研究。有研究表明雌虫腹部脂肪体共生细菌Wolbachia能够产生B族维生素从而增加褐飞虱的产卵力[9],因此褐飞虱雌虫则在羽化2 d至6 d的时间内脂肪体内与繁殖相关的共生细菌大量增殖从而导致单位脂肪体共生细菌数量显著增加。同时,褐飞虱雌虫脂肪体内以类酵母共生菌(Yeast-like symbiotes, YLS)为主的共生真菌数量随着羽化的进行显著增加,大量的研究也证实了YLS能够为褐飞虱发育提供必需氨基酸、固醇类物质以及参与其他的代谢活动[10-12],而在羽化后2 d至羽化后6 d的时间内,YLS从脂肪体释放进入血淋巴后再进入卵巢,通过卵垂直传递给下一代[13],导致单位脂肪体内YLS数量显著下降。褐飞虱雄虫的单位脂肪体共生真菌含量则无显著变化。

吕仲贤等(2001)通过血细胞计数法发现褐飞虱从1龄若虫至羽化阶段YLS数量随着若虫的生长而逐渐增长,但其采用褐飞虱全虫研磨并未对组织进行分离[14]。侯云(2013)通过绝对定量方法检测了褐飞虱各个龄期脂肪体内Noda菌[15]、Pichiaguilliermondii和Candidaquercitrusa的数量变化,发现在1～4龄若虫期,这三种共生菌的数量随着虫龄的增加而增加,但在5龄期数量有显著的下降,而到成虫期数量又有显著地回升,但由于褐飞虱脂肪体含有种类丰富的共生真菌,因此这三种菌并不能完全代表飞虱体内全部共生菌的变化规律[7]。本研究通过绝对定量的方法检测了褐飞虱肠道和脂肪体内共生细菌和共生真菌的数量变化,另外以褐飞虱虫体β-Actin作为对比,能减少组织收集以及核酸提取产生的误差,并更加直观反映单位虫体肠道与脂肪体内的共生菌数量随着褐飞虱龄期变化情况。

本研究建立了褐飞虱体内共生菌的检测方法,同时也研究了褐飞虱不同发育历期肠道与脂肪体内共生菌的数量变化情况,为后续研究褐飞虱和共生菌间的关系提供了依据。