西藏产绵头雪兔子的质量标准研究*

王喜锟 万玉莹 兰钧 次旦多吉 达娃卓玛**

（1.西藏大学医学院；2.西藏自治区食品药品检验研究院中药藏药质量控制重点实验室，西藏 拉萨 850000）

绵头雪兔子属菊科风毛菊属植物绵头雪兔子（Sau⁃ssurea laniceps Hand.-Mazz.）的干燥全草，藏文名为“恰果苏巴”［1］。目前有关绵头雪兔子的化学成分研究报道，绵头雪兔子中主要含香豆素类、黄酮类、木脂素类、甾体类、糖类、生物碱类、萜类等化学成分［2-4］。有关于绵头雪兔子［5-16］的药理学研究报道，绵头雪兔子所含的香豆素类、黄酮类、木脂素类等成分与其抗风湿、镇痛、抗菌消炎、强心、抗损伤、抗氧化及清除自由基、抗癌、终止妊娠等作用有关。另外还有研究报道绵头雪兔子［17］挥发油成分主要为单萜、倍半萜、脂肪酸及其酯和一些长链烷烃、烷醇和烷醛，还有一些芳香化合物等。

雪莲花现行质量标准收载于《卫生部药品标准•藏药•第一册》（以下简称“95部颁”）中，仅收载了性状及显微鉴别，质量标准技术低，因此本项目对绵头雪兔子质量标准进行修订提高研究，为该药材质量控制及合理利用资源提供技术指导。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司，型号：KQ-500DE；超级循环恒温水浴箱：山西海金沙科技有限公司，型号：PTC-6；电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器，型号：DHG-9242A；马弗炉：Yamato，型号：Fo610C；十万分之一天平：瑞士梅特勒公司，型号：AB204-S；十万分之一天平：瑞士梅特勒公司，型号：XP504；万用电炉：北京中兴伟业世纪仪器有限公司，型号：DL-1；纯水/超纯水一体机：默克密理博，型号：Direct 16。

1.2 试药

本实验收集到的11批绵头雪兔子药材，经西藏自治区藏医院格桑巴珠副主任药师鉴定为菊科风毛菊属植物绵头雪兔子（Saussurea laniceps Hand.-Mazz.）的干燥全草。东莨菪内酯购自中国食品药品检定研究院，批号：110768-200504 纯度：100%；7-羟基香豆素购自中国食品药品检定研究院，批号：111739-200501 纯度：100%；色谱纯乙腈；色谱纯甲醇；自制超纯水；分析纯甲醇；分析纯二氯甲烷；分析纯冰醋酸；分析纯甲酸。

表1 绵头雪兔子样品信息

2 方法与结果

2.1 性状观察

本品外形似绵球状、圆柱状或圆锥形，表面黄褐色、灰褐色或深灰色。茎长7～25cm,基部有残存的黑色叶基，呈覆瓦状密集排列，膜质；茎中部至顶端的叶片密集,皱缩卷曲，密被白色或褐色绒毛。完整叶片卵圆形、匙形、倒披针形或狭倒卵形,边缘近全缘或齿状。头状花序集生茎顶，呈半圆球形；花冠紫色、白色或红紫色。稀见瘦果，具白色或黑褐色长冠毛，密集成毡状，形似灰白色绒球，直径4～8mm；可见紫红色或紫黑色的花柱和柱头露于冠毛外，组成紫灰相间的斑点。气淡，味微苦、涩。［1］

2.2 显微鉴别

本品粉末黑褐色，伴有黄褐色棉毛。用水合氯醛透化，稀甘油装片，置显微镜下观察：非腺毛，极多，均由多细胞组成，粗细均匀，绞成团状，多已碎短。冠毛多见，轴多细胞组成，单细胞分枝众多，内层冠毛马尾状，单细胞形如非腺毛，但较直；外层冠毛刺毛状，单细胞短圆锥形。花粉粒众多，淡黄色，球形或类球形，直径28.87～43.74μm，外壁有短刺及疣状雕纹，萌发孔3个。

2.3 薄层鉴别

取绵头雪兔子药材粉末1g，加入甲醇50mL，超声处理60min，滤过，作为供试品溶液。另取绵头雪兔子对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取东莨菪内酯和伞形花内酯对照品，加甲醇制成每1mL 含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502），吸取上述供试品溶液与对照药材溶液6～10μL、对照品溶液3μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸（25︰1︰0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。结果见图3。供试品色谱中，在与对照药材与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

2.4 水分测定

对照2020 年版《中国药典》四部通则0832 第二法，共测定11 批次绵头雪兔子，水分含量最低值6.57%，最高值11.25%（结果见表2），平均值为9.06%.以均值的120%为限，暂定水分限度为不得超过11.0%.

2.5 总灰分测定

共测定11 批次绵头雪兔子，总灰分最低值7.12%，最高值为17.57%，其中17.57%数据过大，对计算结果影响过大，不予统计，其余数据平均值为9.06%（结果见表2），以均值的120%为限度，暂定总灰分限度为不得超过11.0%.

2.6 酸不溶性灰分

共测定11批次绵头雪兔子，酸不溶性灰分最低值0.43%，最高值9.94%，其中9.94%数据过大，对计算结果影响过大，不予统计，其余数据平均值为1.52%（结果见表2），以均值的120%为限，暂定酸不溶性灰分限度为不得超过2.0%.

2.7 浸出物测定

热浸法测定，用水作溶剂，共测定11 批次绵头雪兔子浸出物，可知11批绵头雪兔子的浸出物最低值为18.95%，最高值为34.88%（结果见表2），均值为30.37%，以均值的80%为限，暂定浸出物限度为不得少于24.0%.

表2 绵头雪兔子检查项以及浸出物含量测定（n=2）

2.8 高效液相色谱法测定伞形花内酯含量

2.8.1 对照品溶液的制备。取经五氧化二磷干燥过夜的伞形花内酯对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.04mg的溶液，即得。

2.8.2 供试品溶液的制备。取绵头雪兔子药材粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，加热回流1.5h，取出，放凉，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.8.3 色谱条件与系统适用性试验。色谱柱为Wa⁃ters XSelect CSH C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-1%冰乙酸溶液（10∶90）；检测波长为324 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。分别取“2.8.1”项下对照品溶液、“2.8.2”项下供试品溶液以及空白对照溶液（甲醇），按上述色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，待测成分色谱峰与相邻色谱峰的分离度＞1.5，理论板数按伞形花内酯计不低于3000，并且空白溶液对测定无干扰。说明该方法专属性好。系统适用性试验的高效液相色谱图见图4。

2.8.4 线性关系考察。精密称取经五氧化二磷干燥过夜的伞形花内酯对照品10.22mg，置100mL 容量瓶中，加甲醇溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液，取续滤液1μL、3μL、5μL、7μL、9μL、11μL、13μL，注入液相色谱仪，测定含量，以伞形花内酯进样量为横坐标、峰面积为纵坐标得标准曲线：

伞形花内酯Y=5496817.1652X+10294.5714（R2=0.9998）

表明伞形花内酯进样量在0.1022～1.3286μg 范围内与其峰面积积分值有良好的线性关系。

2.8.5 精密度试验。精密量取0.04896mg/mL 的对照品溶液10μL 注入液相色谱仪，连续进样测定6 次，记录峰面积，计算其RSD 值。结果，伞形花内酯峰面积的RSD为0.96%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.8.6 稳定性实验。取XTZ-1 样品约0.5g，精密称定，按供试品溶液制备方法处理，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h 进样测定，记录每次测得的伞形花内酯的峰面积并计算峰面积RSD 值。结果，伞形花内酯峰面积的RSD 为1.84%（n=6），表明该供试品溶液在室温12小时内稳定。

2.8.7 重复性实验。取XTZ-1 样品约0.5g，精密称定，按供试品溶液制备方法处理，平行取样测定6 次，测定峰面积，计算每次测得伞形花内酯的0.5g 相对峰面积的RSD 值。结果，伞形花内酯的0.5g平均相对峰面积RSD为2.19%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.8.8 加样回收率实验。取已知伞形花内酯含量的XTZ-7样品6 份，每份约0.25g，精密称定，按已知含量（4.26mg/ml）供试品待测成分含量的100%精密加入伞形花内酯浓度为0.02036mg/ml 的对照品溶液50ml（含伞形花内酯1.018mg），按供试品溶液制备方法处理，得相关溶液，进液相色谱仪处理，计算伞形花内酯含量及加样回收率。结果，伞形花内酯的平均回收率为94.46%，RSD 为0.36%，表明该方法准确度良好。结果如表3。

表3 加样回收实验

2.8.9 样品测定。按“2.8.2”项下制备供试品溶液，分别测定11 批样品。结果XTZ-1～XTZ-11 伞形花内酯含量依次为1.13%、0.47%、0.25%、0.28%、0.24%、0.25%、0.43%、0.18%、0.24%、0.21%、0.27%（按干燥品计），最高值为1.13%，最低值为0.18%，因XTZ-1 的含量过大，与其他样品含量相差较大，计入统计影响结果，因此不将其纳入统计范围，其余样品含量平均值为0.28%，以均值的80%为限度，暂定绵头雪兔子伞形花内酯含量按干燥品计算，不得少于0.22%.

3 讨论

3.1 绵头雪兔子药材的检查项及浸出物含量测定

95部颁中，没有收载雪莲花的各检查项及浸出物项。因此，在本次对绵头雪兔子的质量标准修订提高研究中，针对绵头雪兔子的各检查项及浸出物进行了研究。各检查项与浸出物项按照2020 年版《中国药典》［17］各项规定进行测定。

根据文献报道［18］，绵头雪兔子中挥发油含量不高，仅不到1%，因此水分测定选择了操作简单的烘干法进行测定。对于浸出物测定项，分别考察了不同浓度的乙醇溶液和纯化水，以热浸法和冷浸法分别提取，比较各组结果，最终发现，用水作溶剂，热浸法提取，绵头雪兔子的浸出物最高。

3.2 定性与定量对照物质的选择

本文通讯作者在对绵头雪兔子主要成分分析研究［2］过程中发现，香豆素类成分是绵头雪兔子的主要化学成分，其中东莨菪内酯和伞形花内酯的含量相对较高［3］，因此拟以上述对照品建立薄层色谱鉴别方法，又选择了含量相对比较高的伞形花内酯，作为绵头雪兔子含量测定项的指标成分，为绵头雪兔子及其研制产品质量评价提供科学依据。

3.3 薄层色谱条件的探索

在对绵头雪兔子的薄层色谱鉴别研究中，参考了有关伞形花内酯的薄层色谱鉴别研究文献［19］，并参考其他关于薄层色谱鉴别的相关文献报道［20-22］，最终发现，三氯甲烷-甲醇体系，对于伞形花内酯和东莨菪内酯的展开较好。又考虑到三氯甲烷的毒性相对较大，因此将三氯甲烷更换为二氯甲烷来进行展开，展开条件为二氯甲烷-甲醇（25︰1）。在方法探索过程中发现存在拖尾现象，考虑加入少量的甲酸，以防拖尾，最终确定薄层鉴别展开系统为二氯甲烷-甲醇-甲酸（25︰1︰0.1），在硅胶G板上进行展开。并且，后续又对薄层鉴别项进行了方法学研究，对点样量、不同规格的薄层板以及在不同湿度温度条件下进行了展开，发现结果并没有明显差异。说明该方法耐用性好。

3.4 HPLC测定方法的探索

在对HPLC 测定方法探索选择的过程中，笔者对供试品提取方法、提取溶剂以及提取时间做了相应的考察。最终通过所测得的含量结果进行对比，选择了甲醇回流90min 作为最佳的供试品提取方法。接着，以文献作为参考［23-28］，考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱、甲醇-1%冰乙酸（30︰70）、乙腈-1%冰乙酸（15︰85）、乙腈-1%冰乙酸（10︰90）几个系统，根据所得色谱图结果，综合考虑出峰时间、分离度等因素，最终选择以乙腈-1%冰乙酸（10︰90）作为HPLC 测定方法。根据伞形花内酯紫外吸收波长，选择324nm 作为检测波长。并且通过方法学考察研究，结果显示该方法符合含量测定项要求。

综上所述，本研究就显微鉴别、水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物项对绵头雪兔子进行了测定，建立了绵头雪兔子中伞形花内酯和东莨菪内酯的薄层色谱鉴别方法，并针对绵头雪兔子所含伞形花内酯的含量建立了HPLC 测定方法，为西藏产绵头雪兔子的质量标准修订提高提供依据，为西藏产雪莲花的质量控制提供参考。