不同肝纤维化程度的慢性乙型肝炎患者血清FGF-21、PDGF-BB和FBRS水平变化及其临床意义探讨*

李春花，李忠新，张春雷，曾学辉，陈甜甜，宋林立

在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)发病早期，由于临床表现不明显，极易被忽略，导致病情进展。若未能及时接受治疗，CHB患者病情可进一步进展为肝硬化、肝细胞癌(HCC)或终末期肝病[1,2]。研究发现，大部分CHB患者存在程度不一的肝纤维化，早期积极干预可有效逆转病变[3-5]，故及早评估CHB患者肝纤维化程度可为临床干预提供指导，有效改善预后。临床上，针对CHB患者肝纤维化程度的判断多依赖于肝穿刺组织学检查[6]，但肝活检操作本身具有创伤性，可重复性差，且容易受取样误差等因素影响结果，在实际应用中面临一定的限制。故探寻无创、操作性强、可重复性好且准确性良好的评估手段已成为临床相关研究的重点。血清学标志物作为一类非创伤性检测指标被广泛应用于多种疾病的诊断。成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factors-21，FGF-21)作为近年来被发现的一类分泌性蛋白，由肝脏细胞分泌产生，并以肝脏为靶器官，发挥抑制氧化应激反应和炎症反应、调节糖脂代谢的作用[7]，可有效降低肝损伤，但有关其与肝纤维化关系方面的研究仍较少。血小板衍生生长因子-BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)为肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)的有丝分裂原，被认为可能参与肝纤维化进展过程[8]。纤维蛋白(fibrosin，FBRS)系一类由CD4+T细胞产生的细胞因子，具有一定的促纤维化作用[9]。本研究检测了不同肝纤维化程度的CHB患者血清这些细胞因子的水平变化，以探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2020年1月～2021年1月我院收治的CHB患者92例，男性61例，女性31例；年龄为21～53岁，平均年龄为(34.3±8.5)岁。诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》的标准[10]。排除标准：(1)合并甲型、丙型肝炎病毒或HIV感染者；(2)自身免疫性、药物性、酒精性肝病患者；(3)合并恶性肿瘤、严重的内分泌系统疾病、神经系统疾病和血液系统疾病者；(4)妊娠期或哺乳期妇女。本研究经我院医学伦理委员会审批通过，所有受试者签署知情同意书。

1.2 肝活检 患者取左侧卧位或平卧位，在超声导引下行肝穿刺检查，取出肝组织，固定于10%甲醛溶液内、送检。按照《肝纤维化诊断及疗效评估共识》[11]进行肝纤维化分期评估，非显著性肝纤维化为S0～1期，显著性肝纤维化为S2～4期，其中S0期为无纤维化表现；S1期为存在汇管区纤维化扩大，纤维化仅局限于窦周和小叶内；S2期为汇管区周围发生纤维化，伴随纤维间隔产生，保留小叶结构；S3期为形成纤维间隔，出现小叶结构紊乱，无肝硬化；S4期为早期肝硬化。

1.3 实验室指标检测 采集空腹外周静脉血4ml，分为2份，其中1份及时分取血清，采用ELISA法检测血清FGF-21和PDGF-BB水平(北京普利莱基因技术有限公司)；使用南京贝登医疗股份有限公司生产的迈瑞BS-280型全自动生化分析仪检测血生化指标，计算肝纤维化指数-4(fibrosis-4，FIB-4)=年龄×AST/(血小板计数×ALT1/2)；使用迈瑞BC-5000型全自动血细胞分析仪检测血常规；使用全自动免疫分析仪检测血清HBsAg和HBeAg(美国Abbott公司)；使用德国罗氏公司Light Cycler荧光定量PCR仪检测血清HBV DNA(深圳匹基生物工程股份有限公司)；采用放射免疫法检测血清透明质酸(hyaluronic acid，HA)、层粘连蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型胶原(type Ⅳ collagen，ⅣC)和Ⅲ型前胶原(procollagen Ⅲ，PCⅢ，厦门波生生物技术有限公司)；对另一份血液标本，采用实时荧光定量PCR法测定FBRS mRNA水平，具体步骤如下：采用Ficoll-Hyapque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)，加入Trizol试剂提取总RNA，使用NanoDrop 2000微量紫外可见分光光度计检测RNA浓度和质量，置入-80°冰箱冻存备用。应用Primer Premier 5.0基因设计软件设计引物，FBRS正向引物序列：5'-CCTGCCTTCCGGGGCCCTAT-3'，反向引物序列：5'-TGGGGCCCCTGGGCTTTCTT-3'。PCR反应体系：dd H2O 32.5μl，10×LA PCR Buffer 5μl，dNTP Mixture(10mM) 8 μl，正反向引物各1 μl，模板2 μl，TakaRa LA Taq 6 μl，总反应体系为50 μl。PCR反应设定：预变性：95℃ 3 min，PCR扩增：95℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃ 90 s，扩增35个循环，延伸：72 ℃ 10 min，冷却：16℃ 10 min。将GAPDH作为内参，采用2-△△CT法计算FBRS mRNA相对水平。

1.4 肝脏硬度检测(LSM) 使用法国EchoSens公司提供的Fibroscan检测。

2 结果

2.1 组织病理学检查情况 经肝组织病理学检查，在92例CHB患者中，发现S0期12例，S1期37例，S2期16例，S3期15例，S4期12例，其中非显著性肝纤维化组49例，显著性肝纤维化组43例。

2.2 两组基线资料比较 显著性肝纤维化组血清AST、ALT、FIB-4、LSM、LN、PCⅢ、PDGF-BB和PBMCs FBRS水平均显著高于非显著性肝纤维化组(P<0.05)，而血清FGF-21水平显著低于非显著性肝纤维化组(P<0.05，表1)。

表1 两组基线资料比较

2.3 FGF-21、PDGF-BB和FBRS诊断CHB患者显著性肝纤维化的效能分析 四项指标联合诊断的效能显著高于各单项指标(表2、图1)。

表2 各指标诊断CHB患者显著性肝纤维化的效能

图1 各指标诊断CHB患者显著性肝纤维化的ROC曲线

3 讨论

肝纤维化为多种致病因素作用下肝内纤维组织异常增生的病理学过程。若肝损伤、肝细胞炎症坏死等致病因素持续存在，则肝纤维化将持续存在，直至出现肝小叶结构改变、假小叶形成，形成早期肝硬化[12-14]。肝纤维化属于机体面对肝脏炎症的一种修复反应，但其过度增生可使肝小叶结构发生破坏，阻碍局部淋巴回流和血液流通，从而导致门脉高压症。虽然造成肝细胞损伤的因素较为复杂，但肝纤维化的形成主要与肝星状细胞(HSC)相关[15,16]。在HSC异常激活的情况下，细胞外基质可被大量分泌，同时参与降解细胞外基质的基质金属蛋白酶活性降低或合成减少，导致肝内纤维基质沉积增多，而在这一过程中各种细胞因子发挥了重要的作用。本研究结果显示，显著性肝纤维化患者肝损伤更为明显，血清FGF-21水平显著低于非显著性肝纤维化组。FGF21属于一类脂肪细胞因子，在正常情况下由肝脏脂肪细胞分泌，可参与调节胰岛素敏感性，降低胰岛素抵抗并减少脂肪变性，进而增加能量消耗。当CHB患者发生脂质代谢异常时，可引起细胞外基质合成途径改变，促进HSC活化，加重肝纤维化，而此时FGF21可通过对氧化应激反应的抑制改善对乙酰氨基酚造成的肝损伤。同时，它可参与抑制HSC活化，减轻肝纤维化程度[17]。随着CHB患者病情持续进展，循环FGF21由最初的代偿性升高逐渐演变为分泌不足，肝纤维化程度可进一步加重。

HBV感染系肝纤维化的常见诱因，肝脏可出现实质性损伤，出于机体自身修复反应，肝脏局部纤维组织可发生显著增生。虽然肝组织病理性检查可作为肝纤维化诊断的金标准，但其具有创伤性，慢性肝病患者接受检查的依从性较差。目前，临床上常用的肝损伤血清指标在评估肝纤维化时往往容易受局部炎症反应的影响，诊断效能不高。相关研究指出，肝纤维化形成的中心环节为HSC激活、细胞外基质大量分泌[18]，而期间各类细胞因子对HSC的调节、活化作用以及对细胞外基质的降解平衡均可参与肝纤维化的发生过程。在本研究，显著性肝纤维化组血清PDGF-BB和PBMCs FBRS mRNA水平显著高于非显著性肝纤维化组，经ROC曲线分析发现，PDGF-BB和FBRS诊断CHB患者显著性肝纤维化的AUC分别为0.714和0.690，诊断的敏感度和特异度分别为69.8%和69.4%及65.1%和73.5%。当上述指标与FGF-21和LSM联合诊断时，其AUC可达到0.989，敏感度和特异度分别为95.3%和63.3%，提示联合多种指标诊断CHB患者显著性肝纤维化具有良好的效能，但其特异度还不够高。PDGF-BB属于HSC的有丝分裂原。当CHB患者发生肝纤维化时，HSC、肝窦内皮细胞、库普弗细胞在慢性炎症刺激下可生成并分泌PDGF-BB，而PDGF-BB可进一步与HSC所表达的受体结合，刺激HSC活化和增殖[19,20]，从而促进肝纤维化的发生。FBRS可经由成纤维细胞和T淋巴细胞等多种细胞分泌产生，在CHB患者肝损伤和肝纤维化进展过程中，受炎症刺激而活化的HSC和淋巴细胞均可合成并分泌FBRS，而FBRS可进一步刺激HSC活化、胶原分泌和成纤维细胞增殖，从而加重肝纤维化程度。