山羊捻转血矛线虫ITS基因序列分析

要慧中，邹 敏，杨冰可，周璐露，全钺涵，余传奇，林 青,2*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.家畜疫病病原生物学国家重点实验室(中国农业科学院兰州兽医研究所)，甘肃兰州 730046；3.商南县畜牧兽医中心，陕西商南 726300)

捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)是反刍动物胃肠道寄生虫中致病能力极强的一种，主要寄生于山羊、绵羊等家养和野生反刍动物的皱胃和小肠[1]，在世界各国家地区分布广泛且感染率高[2]。山羊、绵羊等反刍动物感染捻转血矛线虫后可出现消瘦、贫血、下腭水肿、生理机能紊乱等慢性消耗性症状，甚至引起幼年动物急性死亡[3-5]，给世界范围内的山羊、绵羊等反刍动物养殖业带来了重大的经济损失[5]。内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)是一段位于18S和28S之间具有种特异性和种内高度保守性的核糖体DNA序列[6-7]，近年来已用于多种线虫的种类鉴定和遗传进化研究[8-10]。基于此，本研究采用PCR技术对陕西省咸阳地区山羊的捻转血矛线虫分离株ITS基因片段进行扩增、测序与分析，以了解和掌握其ITS基因的分子特征与遗传变异情况，为捻转血矛线虫的深入研究及其捻转血矛线虫病的防治提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体样品 虫体分别于2015年、2017年、2019年和2020年采集自陕西省咸阳地区山羊的皱胃内，共采集到样本虫体44条，经形态学初步鉴定全部为捻转血矛线虫。虫体用750 mL/L酒精固定，置于-20℃保存。虫体样品具体信息如下表1所示。

表1 捻转血矛线虫来源信息表

1.1.2 主要试剂TaqDNA Polymerase(CW0680)，康为世纪生物科技有限公司产品；基因组DNA提取试剂盒(DP304-02)，天根生化科技(北京)有限公司产品；TaKaRa ExTaq®(RR001A)、DNA标准DL2000(3427A)、琼脂糖等试剂，宝日医生物技术(北京)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 高速离心机(HC-2514)，安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；PCR仪(TC-XP)，杭州博日科技有限公司产品；全自动凝胶成像分析系统(ChampGel5000)，北京赛智创业科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA的提取 分别选取单个捻转血矛线虫虫体，用双蒸水反复吹打冲洗3次～4次，置于无菌的2 mL Eppendorf管中，再加入200 μL的GA缓冲液用无菌的玻璃棒将虫体捣碎至均一糊状。加入20 μL的蛋白酶K，混匀，置于56℃的水浴锅内消化1 h～2 h，每隔30 min反复颠倒3次～4次。虫体消化完成后按照中国北京天根生化科技有限公司的DNA提取试剂盒说明书提取虫体的基因组DNA。

1.2.2 捻转血矛线虫ITS基因PCR扩增 参考Zhu X等[11]根据线虫核糖体DNA保守区设计的线虫通用引物(引物具体信息见表2，引物由北京擎科生物科技有限公司合成)并建立的方法，以虫体基因组DNA为模板，用PCR方法扩增捻转血矛线虫的ITS目的基因片段，该基因片段包括28S rDNA的5′端、18S rDNA的3′端以及完整的ITS-1、5.8S、ITS-2基因片段。反应体系(25 μL)：双蒸水17.375 μL，TaKaRaTaq酶 0.125 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，上游引物(NC5) 1.0 μL，下游引物(NC2) 1.0 μL，DNA模板 1.0 μL。反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 30 s，35个热循环；72℃ 2 min。扩增产物用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 线虫通用引物

1.2.3 ITS序列测定与比对 将上述扩增出的阳性PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。用Chromas 2生物学软件对测序结果中错读的碱基位点进行矫正，最后使用ClustalX1.83生物学软件，将各序列18 S、28 S基因片段剔除，获得各虫体样本ITS-1、5.8S、ITS-2基因片段。

1.2.4 序列分析 使用NCBI网站内的Blast对校正后的捻转血矛线虫ITS-1、ITS-2序列进行同源性检索。利用生物学软件DNAStar7.1内的Editseq工具计算捻转血矛线虫ITS-1、ITS-2序列中各碱基含量及A+T、G+C含量，使用MEGA-X软件进行ITS-1、ITS-2序列碱基突变位点的记录，使用MegAlign软件对样ITS-1、5.8 S、ITS-2序列进行两两之间变异率的计算，分析2015年、2017年、2019年和2020年陕西咸阳地区羊源捻转血矛线虫ITS-1、5.8 S、ITS-2基因序列的遗传变异情况。

1.2.5 构建系统进化树 从GenBank中分别选取捻转血矛线虫ITS-1、ITS-2 rDNA基因参考序列。ITS-1参考序列包括：陕西(KX534100)、内蒙古(HQ844231)、英国(LS997563)、爱尔兰(JF680983)、美国(EU086389、AF044929)、新西兰(KC998765)、老挝(AB908961)、缅甸(MT568604)、伊朗(HQ389229)、肯尼亚(KP760874)、埃及(AB682684)以及外群艾氏毛圆线虫(Trichostrongylusaxei)ITS-1 rDNA序列(Y15875)；ITS-2参考序列包括：陕西(KX534100)、广东(KM586652)、美国(EU086376)、老挝(MT682966)、老挝(AB908963)、肯尼亚(KP760873)、奥地利(KU891895)、爱尔兰(JF680983)、尼日利亚(LC368048)、加纳(MH481579)、喀麦隆(MN708989)、澳大利亚(KF364629)以及外群似血矛线虫(Haemonchussimilis)ITS-2 rDNA序列(MN709008)。将以上参考序列与本研究的样本(挑选具有代表性的6株虫体样本)，采用最大似然法(Maximum likelihood，ML)分别构建ITS-1和ITS-2基因序列系统进化树，以探究陕西咸阳地区捻转血矛线虫基因进化情况以及与其他地区捻转血矛线虫分离株的进化关系。ML法使用MEGA-X生物学分子软件进行，设置Bootstrap method，复制数为1000，Tamura 3-parameter模型。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

44条捻转血矛线虫DNA样品均成功扩增出850 bp左右的目的基因条带，与预期大小相符，部分样品检测结果如图1。

2.2 测序结果与分析

测序结果显示，44株山羊捻转血矛线虫ITS-1序列长度为400 bp～404 bp，与GenBank数据库中ITS-1参考序列(登录号为LS997563)相似性为97.01%～99.75%；ITS-2长度为231 bp，与GenBank中ITS-2参考序列(登录号为LC368048)相似性为96.97%～100%。5.8 S rDNA基因序列经比对分析后未发现碱基差异。使用Editseq软件测得样本ITS-1序列中A含量为28.47%～29.46%，T含量为30.69%～32.01%，G含量为19.55%～21.04%，C含量为19.06%～20.54%；A+T含量为59.4%～60.89%，G+C含量为39.10%～40.59%；ITS-2序列内A含量为28.95%～32.9%，T含量为34.2%～36.36%，G含量为16.88%～18.42%，C含量为15.58%～16.67%、A+T含量为63.15%～69.26%，G+C含量为32.46～35.09%。ITS-1、ITS-2中A+T碱基含量都明显高于G+C碱基含量。

使用MEGA-X软件将虫体样本的ITS-1、ITS-2序列分别同GenBank中ITS-1参考序列(登录号为LS997563)、ITS-2参考序列(登录号为LC368048)进行序列比对并记录碱基突变位点，发现44株捻转血矛线虫样品ITS-1基因序列存在17个碱基突变位点，包括10个碱基颠换(A↔C，n=2；A↔T，n=1；T↔G，n=5；C↔G，n=2；)、10个碱基转换(A↔G，n=4； T↔C，n=6)；ITS-2基因序列存在15个碱基突变位点，包括5个碱基颠换(T↔A，n=3；C↔G，n=1；T↔G，n=1)、9个碱基转换(A↔G，n=5；T↔C，n=4)和1个碱基插入。MegAlign结果显示(部分虫体样本PCR扩增结果如图2，图3所示)，2015年—2020年间，陕西咸阳地区捻转血矛线虫虫体样本ITS-1序列种内变异率为0～4.1%，ITS-2序列种内变异率为0～6.3%。

M.DNA标准DL 2 000； 1～12.ITS基因PCR产物；13.阴性对照

图2 陕西省咸阳地区捻转血矛线虫部分样品ITS-1基因序列相似性分析

2.3 捻转血矛线虫系统进化树的构建

基于捻转血矛线虫ITS-1、ITS-2基因序列构建ML树(图4、图5)。ITS-1进化树中可以看出虫体样本SX15-1、SX20-6、SX19-10、SX20-10汇聚于进化树同一枝上；虫体样本SX17-3与来自陕西的捻转血矛线虫分离株(KX534100)汇聚于同一支上；虫体样本SX17-5与伊朗的分离株(HQ389229)最为接近。ITS-2进化树中，样本SX15-8、SX17-9、SX17-11汇于同一支上，且与GenBank中来自陕西的分离株(KX534100)最为接近；样本SX20-1与GenBank中来自尼日利亚的分离株(LC368048)最为接近；样本SX17-5与GenBank中来自广东的分离株(KM586652)最为接近。

3 讨论

捻转血矛线虫是危害反刍动物养殖业较为严重的寄生性线虫，对畜牧业的持续健康发展带来了极大的隐患，研究其基因进化可为寻找捻转血矛线虫病的防治措施提供一定的理论依据。核糖体ITS基因作为遗传进化分析当中一种重要的基因标记，现已广泛地应用于寄生虫的物种分类以及遗传进化分析[8-10]。本研究对陕西省咸阳地区44株山羊捻转血矛线虫ITS基因序列进行分析后，发现虫体样本ITS-1序列与GenBank中捻转血矛线虫ITS-1参考序列(登录号LS997563)相似性为97.01%～99.75%；虫体样本ITS-2序列与GenBank中捻转血矛线虫ITS-2参考序列(登录号LC368048)相似性为96.97%～100%，这些结果表明，2015年-2020年间陕西省咸阳地区山羊捻转血矛线虫ITS-1、ITS-2基因均有不同程度的遗传变异发生，但未出现种群分化。另外，将44株样本捻转血矛线虫ITS-1和ITS-2序列分别进行了两两比较，结果显示，ITS-1和ITS-2基因的种内变异率分别为0～4.1%和0～6.3%，ITS-2基因变异率要高于ITS-1基因，这与沈效平[12]关于湖南地区捻转血矛线虫同源性差异(ITS-1为0～3.5%、ITS-2为0～5.8%)的报道相似。这些结果也表明，此地区羊源捻转血矛线虫的ITS基因突变比较低，种内的相似性较高，未发生明显的遗传进化。

图3 陕西省咸阳地区捻转血矛线虫部分样品ITS-2基因序列相似性分析

图4 基于捻转血矛线虫ITS-1序列构建的ML系统发育树

在本试验中，将各虫体样本ITS-1基因序列与GenBank中ITS-1参考序列(LS997563)作比较，发现存在17个碱基变异位点，其中位点225、262与Skorpikova L等[13]报道的捻转血矛线虫ITS-1序列变异位点一致，本研究中ITS-1其余突变位点还未见于其他报道中。样本ITS-2序列与GenBank中ITS-2参考序列(LC368048)比较后，发现存在15个变异位点。18、21、22、63、123、196的变异情况与Shen D D、Dey A R、郭筱璐、Yin F等[14-17]的研究报道相一致。此外，42、61、101、106、112、138、158、160、227、229这10个位点在其他报道还未见到。

图5 基于捻转血矛线虫ITS-2序列构建的ML系统发育树

从构建的ITS-1、ITS-2基因进化树可以看出，2015年-2020年间，样本捻转血矛线虫的遗传进化距离都较为接近，表明近6年内，陕西省咸阳地区羊捻转血矛线虫未出现新的种群分化，并且各国家和地区的捻转血矛线虫遗传进化距离均较为接近。值得注意的是，在ITS-1进化树中，只有虫株SX17-3与GenBank中陕西ITS-1序列(KX534100)汇聚在进化树同一支上，样本SX17-5反而与伊朗的捻转血矛线虫ITS-1序列(HQ389229)最为接近；在ITS-2进化树中，只有样本SX15-8、SX17-9、SX17-11与陕西的捻转血矛线虫ITS-2序列(KX534100)较为接近，而样本SX20-1、SX17-5分别与尼日利亚的捻转血矛线虫ITS-2序列(LC368048)、中国广东的捻转血矛线虫ITS-2序列(KM586652)最为接近。这些结果表明，不同国家和地区的捻转血矛线虫尚未出现新的种群分化，且ITS-1、ITS-2 rDNA的遗传进化与不同地理条件之间的相关性不明显，这与严若峰、林海、蒲善秋等[2,18-19]报道的结果一致。